如何通过质谱技术实现高精度磷酸化蛋白定量？

蛋白质磷酸化是最常见也最关键的翻译后修饰之一，广泛参与细胞信号转导、增殖、分化及凋亡等生物过程。然而，磷酸化位点通常具有丰度低、动态范围广、易受酶降解等特性，给其高通量、定量分析带来了极大挑战。如何通过质谱技术实现高精度磷酸化蛋白定量？作为当前研究磷酸化蛋白的核心工具，质谱技术（Mass Spectrometry, MS）凭借其高灵敏度、高分辨率和高通量的特点，正在逐步突破传统分析方法的局限，为深入理解细胞信号调控机制提供了坚实基础。

 

一、高精度磷酸化蛋白定量前处理策略：从复杂样本中富集磷酸化肽段

1、IMAC 与 TiO₂ 富集技术

由于磷酸化肽在整体蛋白质中的比例极低，富集步骤对于后续质谱分析至关重要。金属离子亲和层析（IMAC）与金属氧化物富集（如TiO₂）是当前最主流的方法：

（1）IMAC 依赖于Fe³⁺或Ga³⁺与磷酸基团之间的亲和力，适用于整体磷酸化肽的富集；

（2）TiO₂ 对单磷酸化肽表现出更高亲和力，适合精细磷酸化位点分析。

 

二、高精度磷酸化蛋白定量定量策略：标签法 vs 无标签法

1、同位素标记法（TMT/iTRAQ）

同位素标记定量，如 TMT（Tandem Mass Tag） 和 iTRAQ（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation），可实现多个样本同时分析，优势包括：

（1）多重并行定量（6-plex至18-plex）；

（2）抗技术误差能力强；

（3）特别适合比较多个处理组之间的磷酸化变化。

 

2、无标记定量（Label-Free Quantification）

在样本数量大或处理组多的情境下，无标记定量因操作简便和成本低被广泛使用。结合高分辨率质谱仪（如Orbitrap）和精准的保留时间校正算法，无标签方法同样可以实现可靠的磷酸化肽定量。

 

三、高精度磷酸化蛋白定量质谱仪选择：高分辨率与高灵敏度缺一不可

1、Orbitrap与TripleTOF技术对比

（1）Orbitrap 系统以其卓越的质量分辨率与定量重现性，适合高覆盖率的磷酸化组学研究；

（2）TripleTOF 系统则在SWATH等数据独立采集（DIA）模式下，具备更快的采集速度与更低的丢失率。

 

四、生物信息学分析：从“位点”走向“功能网络”

1、核心分析内容包括：

（1）磷酸化位点定位与可信度评估（PhosphoRS、Ascore等工具）；

（2）上游激酶预测与通路富集分析（Kinase-Substrate Network, KEGG, Reactome）；

（3）动态变化趋势可视化（热图、时间序列聚类）等。

 

随着质谱技术与样本处理策略的不断优化，高精度磷酸化蛋白定量已不再是“黑箱操作”，而成为可控、可重现、可拓展的科学手段。在百泰派克，我们致力于为科研客户提供高灵敏、高特异的磷酸化蛋白组学解决方案，推动信号通路研究迈向更高维度。

 

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