如何在质谱分析前富集乙酰化肽段？
蛋白质乙酰化主要发生在赖氨酸残基（K）上，是一类重要的翻译后修饰。由于其修饰位点低丰度、信号弱且背景复杂，在进行LC-MS/MS质谱分析前，必须采用特异性富集策略以提取目标肽段，提高检测灵敏度。在质谱分析前对乙酰化肽段（acetylated peptides）富集，是研究蛋白乙酰化修饰（acetylation）必不可少的步骤。由于乙酰化修饰在复杂生物样本中通常含量低、丰度差异大，若不经过富集，质谱可能无法有效检测出这些关键修饰位点。本文将从原理、主流方法、技术挑战及优化策略四个方面，系统介绍如何高效富集乙酰化肽段。
一、乙酰化肽段富集原因
1、乙酰化修饰的特征
蛋白质乙酰化多发生于核蛋白和酶类，调节其活性、稳定性或细胞定位。与磷酸化相比，乙酰化位点更分散、低丰度，且缺乏统一的二级结构偏好。
2、质谱识别难点
在未经富集的条件下，乙酰化肽段常常被更高丰度的非修饰肽所掩盖，造成质谱信号无法准确识别乙酰化位点。
3、富集的重要性
只有通过选择性地富集乙酰化肽段，才能在高通量质谱平台上实现足够的检测深度，进而获得可信赖的修饰图谱。
二、乙酰化肽段富集的主流方法
1、抗体亲和富集
（1）原理
使用针对乙酰化赖氨酸（Ac-Lys）的单克隆抗体，通过免疫沉淀的方式选择性捕获乙酰化肽段。
（2）流程简述
① 蛋白酶（如Trypsin）消化蛋白
② 肽段孵育于包被抗体的磁珠或树脂上
③ 洗脱乙酰化肽段
④ LC-MS/MS 分析
（3）优缺点
优点：
① 高专一性，适用于复杂样本（组织、细胞系）
② 可用于不同类型样本的通用平台
缺点：
① 成本较高
② 抗体批间差异影响重复性
③ 某些低亲和力的乙酰化位点可能富集效率低
2、化学衍生结合策略
（1）原理
将乙酰化赖氨酸位点进行化学衍生，使其具有可被亲和基团识别的标签（如biotin），进而通过链霉亲和素（streptavidin）富集。
（2）流程简述
① 化学衍生（如hydrazide reaction）
② 与亲和载体结合
③ 洗脱富集肽段
④ LC-MS/MS 分析
（3）优缺点
优点：
① 可提高某些低丰度位点的检测概率
② 方法可控性强，适用于定量研究
缺点：
① 实验步骤复杂，易造成样本损失
② 对化学反应条件敏感，需严格优化
3、质谱标签结合富集
在定量蛋白乙酰化组学研究中，常结合TMT/iTRAQ等同位素标记手段，先标记肽段后再进行抗体富集，实现多样本并行比较。
三、乙酰化肽富集效果的评估指标
一个有效的乙酰化富集流程，需关注以下几个核心指标：
1、特异性：乙酰化肽段在总肽段中的比例，通常要求 > 80%
2、重复性：多个样本/技术重复中富集位点的一致性
3、覆盖度：可检测乙酰化位点的数量及其分布范围
4、背景干扰：非特异性结合的非乙酰化肽段比例
四、提升乙酰化富集效率的优化策略
1、样本量与酶解效率
（1）富集前推荐使用 ≥1 mg 蛋白输入
（2）酶解效率直接影响肽段数量与多肽完整性
2、缓冲体系优化
（1）高盐或pH偏移会影响抗体结合效率
（2）富集缓冲液中可加入0.1% NP-40以减少背景
3、洗脱与洗涤
（1）梯度洗脱或低pH可提高乙酰肽回收率
（2）合理设置洗涤次数可降低非特异性结合
4、高分辨质谱平台的联合使用
采用如Orbitrap Fusion Lumos、Exploris等高端质谱平台有助于提高位点深度与定量准确性
五、蛋白乙酰化研究的应用场景
1、肿瘤标志物筛选：发现与癌症发生发展相关的关键乙酰化位点
2、代谢调控机制研究：解析乙酰化在代谢酶活性调节中的作用机制
3、药物作用机制解析：例如HDAC抑制剂对细胞中乙酰化水平的影响
4、蛋白互作网络调控：探索乙酰化修饰对PPI网络的影响与调控机制
蛋白质乙酰化是一种广泛存在于真核细胞中的翻译后修饰，尤其是赖氨酸残基上的ε-N-乙酰化（Lysine acetylation），被认为在调控转录、代谢、DNA修复、信号传导等过程中发挥关键作用。由于乙酰化肽段在复杂蛋白质组中丰度较低、信号弱，因此在质谱分析前进行有效的富集处理，是开展乙酰化修饰组学研究的关键前提。百泰派克提供一站式乙酰化质谱服务优势：提供从样本制备、乙酰化富集、质谱分析到生物信息学解读的完整服务流程，包括：高亲和抗体富集体系；Orbitrap高分辨率质谱平台；支持TMT/iTRAQ等定量实验设计；个性化乙酰化通路富集分析；中英文结果报告+生信图表可视化。
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