膜蛋白结构测定的挑战与创新技术

膜蛋白是细胞与外界沟通的“语言中枢”和“物质通道”，在信号转导、离子转运、物质交换中发挥核心作用, 它承担了超60%的药物靶点功能,是药物研发、生物工程、疫苗设计的核心命题。膜蛋白不再是结构生物学的禁区。得益于Cryo-EM的突破与质谱辅助结构学的加持，研究者能够在更短周期内获得功能相关构象信息，加快靶点验证与新药筛选。然而，面对其疏水性强、易聚集、稳定性差、构象异质性高等特性，膜蛋白的三维结构解析远比常规可溶蛋白复杂。传统结构生物学方法常常“无从下手”。如今，研究膜蛋白结构测定的挑战与创新技术成为了前沿急需研究的重要课题。

 

一、膜蛋白结构测定的五大核心挑战

1、表达难、产量低

膜蛋白多为跨膜多螺旋结构，疏水性强，容易在细胞内聚集或引发毒性，常规表达系统（如大肠杆菌）难以实现高效表达。真核系统虽有所改善，但成本和通量受限。

 

2、提纯难、构象易变

膜蛋白稳定性严重依赖于脂质环境，一旦脱膜提纯极易变性。即使采用去污剂或脂双层模拟体系，也可能改变其原始构象。

 

3、晶体难生、衍射差

X射线晶体学要求形成规则晶格，而膜蛋白的柔性区域和多种构象状态极大增加结晶难度，即便成功结晶，X射线衍射分辨率往往不理想。

 

4、构象多态、状态依赖强

膜蛋白常处于不同的功能状态（如激活态、静息态、配体结合态等），一个样本可能存在多种构象共存，增加结构重建的复杂度。

 

5、功能依赖复杂体系

膜蛋白的结构与功能密切依赖辅因子、脂质环境、伴侣蛋白等协同作用，这对结构测定提出更高的复构需求。

 

二、主流结构测定技术在膜蛋白研究中的表现

1、冷冻电镜（Cryo-EM）：突破性进展的核心力量

过去十年，Cryo-EM单颗粒成像技术（SPA）的分辨率不断提升，被誉为膜蛋白结构测定的“拯救者”。其优势包括：

（1）无需结晶：规避结晶瓶颈，适合膜蛋白天然构象

（2）类脂模拟环境：纳米盘（Nanodisc）、SMALPs等保留脂质包裹结构

（3）适合构象多样体分析：机器学习算法可识别激活态/配体结合态等亚构象

近年来，众多GPCR、ABC转运体、离子通道的高分辨Cryo-EM结构不断发表，PDB中Cryo-EM膜蛋白结构数量已超过X射线方法。

 

2、X射线晶体学：仍适用于高稳定性膜蛋白

对于部分构象稳定、表达量高的膜蛋白，如光敏感蛋白（Rhodopsin类），仍可借助脂立方相晶体法（LCP）进行结晶。

（1）分辨率可达1.5 Å以上

（2）可用于小分子配体结合位点解析

但应用面较窄，更多作为验证性工具或高通量筛选平台的结构基础。

 

3、核磁共振（NMR）：小型膜蛋白的溶液结构平台

NMR适用于分子量小、构象柔性的膜蛋白，尤其在下列场景中表现突出：

（1）跨膜螺旋对排列研究

（2） 构象动态与配体诱导机制

（3）与脂类/胆固醇等成分相互作用

配合微胞、纳米盘等膜模拟体系，可在接近生理条件下研究构象变化。

 

三、创新技术助力膜蛋白结构研究新突破

1、质谱辅助结构学（MS-based Structural Biology）

质谱正在成为膜蛋白结构研究的强有力补充工具，尤其在构象筛选、复合体建模、功能验证中展现出独特价值。

（1）交联质谱（Crosslinking-MS）

通过可控长度的化学交联剂，将亚基或结构域之间的空间约束信息“打标”出来，再通过质谱解析交联位点，实现：

• 亚单位构象关系建模

• 配体结合前后构象变化分析

• 抗体表位验证

 

（2）氢氘交换-MS（HDX-MS）

用于研究不同条件下蛋白柔性区域的变化，可揭示：

• 激动剂/抑制剂引发的构象切换

• 构象稳定性变化（如突变、脂质加入）

• 抗原与抗体结合区间的溶剂保护性差异

 

（3）Native质谱+离子迁移谱（Native MS + IM-MS）

保持非变性状态下分析膜蛋白的构象大小、复合体组装状态，并支持配体结合分析。

 

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