多肽测序技术解析：挑战与突破
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抗体CDR区的氨基酸顺序确认
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内源性活性肽（如激素、细胞因子）的鉴定
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生物制剂降解产物的结构确认
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多肽药物的质量控制与杂质检测
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表位筛选与T细胞识别位点研究
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样本纯化 → 去除高背景盐离子及杂质
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离子化（ESI或MALDI）→ 将肽段转为带电粒子
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一级质谱筛选母离子 → 精准挑选目标肽段
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二级质谱碎裂（CID/HCD/ETD） → 获取碎片图谱
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序列分析：通过数据库搜索或de novo算法重构序列
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快速、高通量、分辨率高
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可结合修饰识别和定量分析
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精确度高，适用于纯多肽样品
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对短肽段（<30 aa）解析能力较强
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不适用于N端封闭或修饰肽
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通量低，难以自动化
一、什么是多肽测序？为何如此关键？
多肽是由2~50个氨基酸残基组成的短链蛋白片段，既可能是蛋白质降解产物，也可能是功能性信号分子、生物活性药物，甚至是疫苗抗原表位或TCR肽段。
多肽测序的主要目的包括：
由于多肽结构短小，传统蛋白质测序流程在此面前显得捉襟见肘，催生了针对多肽特性的专用测序方案。
二、多肽测序的主流技术路线
当前多肽测序技术主要可分为两大类：基于质谱的序列分析（MS/MS）和化学降解法（如Edman）。
1、LC-MS/MS串联质谱测序
（1）主要流程包括：
（2）适用优势：
2、Edman降解法
Edman降解是最经典的化学测序方法，通过循环性剥离N端氨基酸残基并逐一鉴定，获取序列。
（1）适用优势：
（2）限制：
随着质谱灵敏度与生信算法的进步，现代多肽测序更偏向质谱+AI辅助序列重构的方向发展。
三、多肽测序中的关键挑战
尽管技术手段日益成熟，但在实际应用中，多肽测序仍面临多个技术瓶颈：
1、修饰种类复杂，影响碎裂模式
天然或合成多肽中常见多种翻译后修饰（PTMs），如磷酸化、羟脯氨酸、N端乙酰化等，这些修饰可能影响质谱碎裂效率，干扰序列推断。
2、同分异构肽难以区分
多肽中存在大量同分异构体（如Leu/Ile，Gln/Lys）无法通过质谱直接区分，需要额外的化学验证或AI辅助建模。
3、信号弱、背景高
多肽相较于完整蛋白更易丢失信号，尤其在复杂背景样本中（如血浆、细胞裂解液），测序难度大幅上升。
4、N端修饰与封闭问题
某些生物样本中的多肽具有阻断性修饰，导致N端Edman降解失效，也会影响数据库匹配算法的有效性。
四、技术突破与前沿发展
为应对上述挑战，科研界与产业界已在多个维度取得重要进展：
1、高分辨率质谱系统的应用
如 Orbitrap Eclipse、timsTOF Pro 2 等高端平台可提供更高质量的MS/MS谱图，提升异构体区分能力与低丰度信号检测率。
2、多酶酶切与分段合成策略
通过使用多种特异性酶（如Trypsin + Glu-C + Chymotrypsin）对肽段进行补充切割，扩大测序窗口，提升序列覆盖率。
3、AI赋能的de novo序列重建算法
深度学习模型（如DeepNovo、PointNovo、pNovo+）能够根据碎片模式重建氨基酸顺序，尤其适用于数据库外序列或高度修饰肽段。
4、联合结构建模与修饰预测
结合AlphaFold结构预测与修饰位点数据库（如Unimod、dbPTM）辅助识别关键功能肽段并进行结构确认，提升生物学解释力。
五、百泰派克生物科技的多肽测序解决方案
在实际科研和项目开发中，多肽测序不仅要求技术精度，更需要从样本制备到数据解读的整体方案设计。百泰派克生物科技构建了一套针对不同应用场景的多肽测序服务平台，具备以下核心优势：
1、高灵敏度平台：搭载Orbitrap Eclipse、timsTOF等高分辨率质谱系统
2、多重酶切策略：根据肽段特性定制酶解方案，最大化覆盖率
3、AI辅助分析引擎：结合数据库比对与de novo预测，准确识别未知肽段
4、修饰位点识别能力强：支持磷酸化、乙酰化、糖基化等常见PTM识别
5、可视化报告交付：提供序列图谱、修饰注释、结构预测等直观结果
随着质谱仪器的性能升级和AI算法的不断成熟，多肽测序正在从“序列获取”向“功能解读”跃迁。未来的多肽测序不仅要“测得准”，更要“懂得多”——包括功能区域、修饰模式、结构信息和生物活性。而生物信息学平台与实验平台的深度融合，也将进一步推动多肽测序在药物发现、免疫疗法、分子机制研究中的价值释放。
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