蛋白质测序：技术方法和应用

蛋白质是细胞活动的执行者，其功能取决于精确的氨基酸序列。一旦序列发生改变，蛋白的结构、相互作用和生物学功能都可能受到显著影响。蛋白质测序（Protein Sequencing）不仅有助于解析蛋白功能机制，更在疾病研究、抗体开发、新药靶点筛选等方面发挥着基础性作用。自20世纪中期以来，蛋白质测序技术不断进化，从Edman降解法走向高通量质谱平台，覆盖能力与数据精度显著提升，正逐渐成为现代蛋白质组学研究的核心手段。

 

一、蛋白质测序的主流技术方法

1、Edman降解

Edman降解是一种顺序性地从N-末端逐个切割氨基酸的化学测序法，适用于小肽或纯化蛋白。反应原理是利用苯异硫氰酸（PITC）选择性标记并释放N端氨基酸残基，然后通过色谱手段进行鉴定。

🔸技术优点：

• 高精度

• 单一序列解析，适合蛋白质N端验证

🔸主要局限：

• 不能处理复杂混合样本

• 仅限于N端分析，无法揭示翻译后修饰

• 通量低，已不适合大规模蛋白组研究

尽管在高通量质谱出现后应用大幅减少，Edman降解仍被用于某些N端封闭验证或重组蛋白鉴定场景中。

 

2、质谱法

当前蛋白质测序主要依赖质谱法（Mass Spectrometry, MS），通过对蛋白样本进行酶解后，在高分辨质谱平台上分析其肽段碎片谱图，推断出蛋白的一级结构信息。

🔸常用质谱测序策略：

（1）基于数据库的测序（Database-dependent sequencing）

这是通过将MS/MS谱图与已知蛋白数据库中理论肽段匹配，从而确定蛋白序列的方法。

▸流程特点：

• 高效、自动化程度高

• 依赖高质量数据库（如UniProt、NR、Swiss-Prot）

• 可结合肽段定量（如TMT/iTRAQ）

常用算法工具包括：Mascot、Sequest、MaxQuant、Proteome Discoverer。

（2）De novo测序（无数据库依赖）

当研究对象缺乏可靠参考数据库，或希望发现未知突变、变异肽段时，de novo测序成为首选方法。该方法直接从MS/MS谱图推断氨基酸序列，不依赖已有数据库。当前主流的de novo工具包括：PEAKS、Novor、pNovo、DeepNovo等。

（3）顶端下游整合策略（Top-down vs. Bottom-up）

质谱测序常按分析方式分为：

• Bottom-up（自下而上）：将蛋白酶解成肽段后进行质谱分析，是目前最主流方式。优点是灵敏度高、通量大，适合复杂样本。

• Top-down（自上而下）：直接分析完整蛋白分子的质谱行为，可提供更丰富的结构修饰信息，但对仪器分辨率要求更高，适用于结构蛋白、变体蛋白等。

 

二、蛋白质测序的应用场景

1、生物标志物发现

通过比较不同状态（如健康与疾病、处理组与对照组）样本中蛋白质序列的变化，可识别出疾病相关突变肽段、新抗原、剪接变体等潜在生物标志物。

 

2、疾病机制研究

蛋白质序列的变异或翻译后修饰是多种疾病发生发展的核心因素。通过蛋白质测序可揭示：

• 激酶调控网络中的磷酸化位点

• 组蛋白修饰（乙酰化、甲基化）与基因表达关系

• RNA剪接变异引发的结构功能异常

 

3、抗体测序与生物药开发

蛋白质测序在抗体类生物药研发中扮演关键角色，主要应用于：

• 抗体序列确认（重链/轻链识别）

• 稳定性分析（序列微差识别、点突变检测）

• 杂质蛋白检测（免疫原性控制）

 

4、非模式生物和新物种研究

对于缺乏基因组信息的非模式生物，质谱结合de novo测序可直接获取关键蛋白序列信息。典型应用包括：

• 农业生物种质资源筛选

• 海洋生物功能蛋白发掘

• 昆虫、微生物天然产物酶活研究

 

5、PTM位点识别与功能研究

翻译后修饰（Post-Translational Modifications）是调控蛋白功能的核心机制。常见修饰包括：

• 磷酸化（Phosphorylation）

• 乙酰化（Acetylation）

• 泛素化（Ubiquitination）

• 糖基化（Glycosylation）

通过特异富集策略结合质谱测序，研究者可在全蛋白水平上定位修饰位点、定量修饰程度，从而揭示复杂调控网络。

 

蛋白质测序作为连接基因信息与蛋白功能的桥梁，了解其包含的技术方法和应用领域是必不可少的。百泰派克生物科技致力于打造“从样本到数据”的一站式蛋白测序解决方案，依托先进仪器平台与经验丰富的质谱团队，为科研与产业客户提供高质量、可溯源的测序服务，助力每一个生物发现更进一步。

 

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