凝胶过滤法蛋白质分子量测定：关键点和实际应用

蛋白质分子量测定是研究其结构、功能和生物学特性的重要步骤。凝胶过滤色谱（Gel Filtration Chromatography, GFC），也称为分子排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），是一种基于蛋白质分子大小进行分离和测定的方法。该技术广泛应用于蛋白质纯化、分子量估算以及复合物形成分析。本文将深入探讨凝胶过滤法的基本原理、实验关键点、数据解析以及其在蛋白质分子量测定研究中的实际应用。

 

一、凝胶过滤法的基本原理

1、工作机制

凝胶过滤色谱通过多孔球形填料（凝胶介质）来分离不同大小的蛋白质分子。当蛋白质样品通过色谱柱时，小分子蛋白可以进入填料的微孔，大分子蛋白由于体积较大难以进入孔洞，从而优先流出色谱柱。

（1）大分子蛋白 → 不能进入填料孔洞，流出速度快，洗脱体积（elution volume, Ve）较小

（2）小分子蛋白 → 能进入填料孔洞，滞留时间较长，洗脱体积较大

这种基于分子大小的分离方式，使得凝胶过滤不仅可用于蛋白质纯化，还能用于蛋白质分子量测定。

 

2、关键参数

（1）体积参数

• 柱体积（Vt）：整个色谱柱的总体积

• 柱空隙体积（Vo）：大分子完全排除填料孔洞时的洗脱体积（通常通过蓝色葡聚糖等大分子物质测定）

• 洗脱体积（Ve）：目标蛋白洗脱的体积

• 相对洗脱体积（Kav）：用于计算蛋白质的分子量



​（2）凝胶填料

• 主要由葡聚糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）、聚丙烯酰胺（Bio-Gel）或硅胶基质组成。

• 选择合适的填料孔径范围，确保目标蛋白可以有效分离。

 

二、凝胶过滤法蛋白质分子量测定的实验关键点

1、选择合适的凝胶填料

（1）填料孔径（Fractionation Range）：应与目标蛋白的分子量匹配。例如：

• Sephadex G-75（适用于 3-70 kDa）

• Superdex 200（适用于 10-600 kDa）

（2）若蛋白质分子量远小于或大于填料适用范围，则分离效果会降低。

 

2、校准标准曲线

采用一系列已知分子量的标准蛋白进行校准，绘制标准曲线：



其中，MW 是分子量，Kav 由实验测得。通过标准曲线推算未知蛋白的分子量。

 

3、样品制备

（1）样品需彻底溶解，无沉淀或聚集体，避免堵塞色谱柱。

（2）适当过滤或离心去除颗粒杂质。

（3）添加 DTT 或 β-巯基乙醇 以破坏二硫键，防止蛋白质聚集。

 

4、实验条件

（1）流速：通常较低（0、2-1 mL/min），避免流速过快导致分辨率下降。

（2）缓冲液：需适配蛋白性质，如 PBS、Tris-HCl、Hepes 等，防止蛋白变性或聚集。

（3）温度控制：低温（如 4°C）可减少蛋白降解。

 

5、数据分析

（1）记录蛋白洗脱峰（UV 280 nm），确定 Ve 值。

（2）将 Ve 代入标准曲线计算蛋白分子量。

（3）若蛋白出现多个峰，可能存在二聚体、聚集体或蛋白复合物。

 

三、凝胶过滤法蛋白质分子量测定的实际应用

1、 估算天然蛋白质的分子量

由于SDS-PAGE 仅能测定变性蛋白的表观分子量，凝胶过滤可用于测定天然状态下的分子量，确认蛋白是否为单体、二聚体或更高聚体。例如，单体蛋白在 SDS-PAGE 上显示 30 kDa，但在凝胶过滤中出现 60 kDa 峰，提示其可能为二聚体。

 

2、 蛋白质复合物的分析

研究蛋白质是否与其他分子结合形成复合物。例如：

（1）核酸结合蛋白的分子量增加，提示其与 DNA/RNA 结合。

（2）免疫复合物的大小变化，反映抗原-抗体相互作用。

 

3、 蛋白质纯度和聚集体检测

在生物制药和蛋白药物开发中，检测蛋白聚集体 是关键步骤，因聚集体可能影响蛋白功能或导致免疫原性。

 

4、 监测蛋白质构象变化

某些蛋白质在不同 pH、温度或离子浓度下会发生构象变化，导致分子量变化。例如，某些伴侣蛋白（如 Hsp70） 在 ATP 存在与否时可能形成不同的寡聚体状态，凝胶过滤可用于监测这一变化。

 

四、凝胶过滤法的优势与局限性

1、优势

（1）温和分离，不破坏蛋白质天然结构，适用于天然蛋白的分子量测定。

（2）高分辨率，可区分不同聚集状态的蛋白，如单体、二聚体、四聚体等。

（3）适用于大分子复合物分析，可用于研究蛋白-蛋白、蛋白-核酸相互作用。

（4）可与 HPLC、FPLC 结合，提高分离效率。

 

2、局限性

（1）精度低于质谱，仅提供近似分子量，无法获得精确的氨基酸序列信息。

（2）样品要求高，蛋白质必须保持稳定，避免聚集或沉淀。

（3）难以分辨相似大小蛋白，若两种蛋白的分子量相近，分离效果有限。

 

凝胶过滤色谱（SEC）广泛应用于蛋白质的分子量测定、复合物分析、聚集体检测和构象研究。尽管其精度不及质谱，但其温和、非变性的分离方式使其成为研究天然蛋白质状态的重要工具。随着新型填料和自动化技术的进步，如 高分辨 SEC-HPLC 和 多角度光散射（MALS） 结合使用，凝胶过滤在蛋白质分析中的应用将进一步拓展，为生物医药、蛋白组学和结构生物学研究提供更强有力的支持。百泰派克生物科技一直致力于为客户提供高质量的蛋白质分子量测定服务，采用先进的凝胶过滤方法，精准测量蛋白质分子量，为您的研究提供可靠的数据支持。如需了解更多关于蛋白质分子量测定：凝胶过滤方法、关键点和实际应用的信息，欢迎与我们合作，共同推动科研进步。

 

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