SDS-PAGE在蛋白质分子量测定中：应用和优势

蛋白质分子量的测定是生命科学研究中的基本实验步骤，对于蛋白质结构分析、表达水平评估和纯度检测具有重要意义。其中，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 是最常用的方法之一，以其高效、经济和可重复性强的特点广泛应用于蛋白质研究。本文将介绍 SDS-PAGE 的技术原理、实验流程、应用场景、优势及局限性，并探讨其在蛋白质分子量测定中的重要作用。

 

一、SDS-PAGE 的技术原理

SDS-PAGE 的核心原理是 基于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率来推测其分子量。该方法利用 SDS（十二烷基硫酸钠，Sodium Dodecyl Sulfate） 将蛋白质变性，使其仅根据分子量而非电荷进行分离。

1、 SDS 在蛋白质分离中的作用

（1）SDS 是一种强阴离子去污剂，能够与蛋白质的疏水区结合，使蛋白质完全变性并形成线性多肽链。

（2）由于 SDS 赋予蛋白质均一的负电荷，因此在电场作用下，所有蛋白质仅根据其分子量大小进行迁移。

 

2、 聚丙烯酰胺凝胶的分离机制

（1）凝胶浓度调控分离范围：聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小取决于单体（丙烯酰胺）和交联剂（N,N'-亚甲基双丙烯酰胺）的比例。低浓度凝胶适用于大分子蛋白分离，而高浓度凝胶适用于小分子蛋白分离。

（2）蛋白质迁移与分子量关系：较小的蛋白质能更容易穿透凝胶孔隙，因此分子量小的蛋白迁移得更远，而分子量大的蛋白移动较慢。

 

3、 迁移率与分子量的对数关系

蛋白质在 SDS-PAGE 中的迁移率（Rf 值）与其分子量的对数呈负相关，即：

log(MW)=a−b×Rf

其中 MW 为蛋白分子量，Rf 为迁移率。因此，通过测定标准蛋白的 Rf 值，可以绘制标准曲线，从而估算未知蛋白的分子量。

 

二、SDS-PAGE蛋白质分子量测定的实验流程

1、 凝胶制备

（1）分离凝胶（Resolving Gel）：主要用于分离蛋白质，浓度通常为 6%-15%，根据蛋白质分子量大小选择适当的浓度。

（2）浓缩凝胶（Stacking Gel）：浓度较低（通常为 4%-5%），用于提高分辨率，使蛋白质在进入分离凝胶前聚集成窄条带。

 

2、 样品处理

蛋白质样品需与 SDS 变性缓冲液（含 β-巯基乙醇或 DTT）混合，在 95°C 加热 5-10 分钟，使蛋白质完全变性并形成均匀的负电荷。

 

3、 电泳

在缓冲液（Tris-Glycine-SDS）中，以恒压或恒流进行电泳，一般 100-200V 运行 1-2 小时，直到指示染料（如溴酚蓝）到达凝胶底部。

 

4、 蛋白质染色

（1）考马斯亮蓝染色（Coomassie Brilliant Blue Staining）：常用染色方法，灵敏度约为 50-100 ng。

（2）银染（Silver Staining）：高灵敏度，可检测到 1 ng 级别的蛋白质。

（3）荧光染料（如 SYPRO Ruby、CyDye）：适用于定量分析和高灵敏度检测。

 

5、 分子量计算

通过与标准蛋白 Marker 进行对比，利用标准曲线估算未知蛋白的分子量。

 

三、SDS-PAGE 在蛋白质分子量测定中的应用

1、 确定蛋白质的分子量

（1）通过 SDS-PAGE 可估算未知蛋白的表观分子量，用于初步鉴定。

（2）在蛋白质纯化后，利用 SDS-PAGE 可确认目标蛋白是否为预期分子量。

 

2、 评估蛋白纯度

用于检测蛋白纯化过程中的杂质蛋白条带，以确保目标蛋白的纯度符合实验要求。

 

3、 监测蛋白表达

在重组蛋白表达实验中，SDS-PAGE 可用于比较不同诱导条件下蛋白的表达水平，评估表达系统的优化情况。

 

4、 检测蛋白翻译后修饰

由于翻译后修饰（如磷酸化、糖基化）会影响蛋白的分子量，SDS-PAGE 可用于观察蛋白迁移率变化，提示可能的修饰发生。

 

四、SDS-PAGE蛋白质分子量测定的优势及局限性

1、 SDS-PAGE 的优势

（1）操作简单，实验流程易于掌握，设备成本较低。

（2）适用范围广，可检测大多数蛋白质，适用于生物医药、蛋白组学等领域。

（3）重复性好，电泳结果具有较高的稳定性，适合日常实验室检测。

（4）分辨率较高，能够清晰区分 5-250 kDa 范围内的蛋白质。

 

2、 SDS-PAGE 的局限性

（1）分子量测定的精度有限：SDS-PAGE 只能提供蛋白质的“表观分子量”，受翻译后修饰和蛋白结构影响。

（2）无法识别蛋白序列：SDS-PAGE 只能分离蛋白，不能提供蛋白氨基酸序列信息，需要结合质谱（MS）或蛋白质印迹（Western Blot）进行鉴定。

（3）低丰度蛋白检测灵敏度较低：考马斯亮蓝染色检测下限较高，需要使用银染或荧光染色提高灵敏度。

（4）难以分辨相似分子量蛋白：如果两种蛋白质的分子量非常接近，可能无法实现清晰区分，需要更高分辨率的方法（如 2D-PAGE）。

 

SDS-PAGE 作为蛋白质分子量测定的经典方法，凭借其操作简便、成本低、重复性好的优势，在生物研究和药物开发中仍然占据重要地位。尽管其在高精度分子量测定和翻译后修饰分析方面存在一定局限，但与Western Blot、LC-MS 等方法结合使用，可以更全面地解析蛋白质的分子特性。凭借专业的技术团队和7大质量控制检测平台，百泰派克生物科技为从事蛋白质组学研究的科研人员提供高质量基于SDS-PAGE的蛋白质分子量测定服务，获得广泛认可。

 

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