免疫细胞中蛋白乳酰化的DIA-MS定量分析策略
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Orbitrap Exploris 480 或 Fusion Lumos
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搭配纳流LC系统（如EASY-nLC 1200）
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窗口数目：24–36个窗口（每窗口宽度~20 m/z）
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MS1分辨率：60,000；MS2分辨率：30,000
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循环时间控制在3s以内，兼顾深度与覆盖
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动态排除时间：适度放宽，避免丢失低丰度乳酰化肽
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使用项目内DDA数据+Spectronaut内置库构建spectral library；
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支持library-free DIA分析（如directDIA）识别更多未知位点
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Spectronaut：业内广泛用于DIA分析
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DIA-NN：快速建库+高识别率
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MaxDIA（MaxQuant模块）：支持label-free DIA分析
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采用Top3/TopN肽段强度进行蛋白层定量
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利用Fragment ion-level intensity提升位点定量精度
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FDR控制在1%，确保结果可信
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GO/KEGG通路富集 → 揭示乳酰化调控网络
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motif分析 → 分析乳酰化酶可能识别序列
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与乙酰化/PTM数据库交叉 → 挖掘修饰共调控模块
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蛋白互作网络（PPI） → 分析关键乳酰化hub蛋白
在炎症、感染和肿瘤等复杂微环境中，免疫细胞的代谢状态变化常伴随着一系列转录和功能重编程。近年来研究表明，乳酸作为糖酵解的关键代谢产物，不仅调节细胞外酸性环境，还能通过乳酰化修饰影响蛋白功能和基因表达。尤其在巨噬细胞、树突状细胞、T细胞等免疫细胞中，蛋白乳酰化（protein lactylation）被认为是一种重要的代谢-表观遗传耦合信号。免疫细胞中蛋白乳酰化的DIA-MS定量分析揭示了其动态变化机制。本文将详解如何在免疫细胞中应用DIA-MS策略，实现乳酰化修饰蛋白的高通量、精准、可重复的定量分析。
一、为什么选择蛋白乳酰化的DIA-MS定量分析？
DIA（Data Independent Acquisition）相较于DDA（Data Dependent Acquisition），具有以下优势：
由于乳酰化修饰本身丰度低、位点稀疏、易被乙酰化等共修饰掩盖，因此DIA-MS成为免疫细胞乳酰化研究的优选策略。
二、蛋白乳酰化的DIA-MS定量分析
开展DIA-MS乳酰化定量分析前，需精心设计实验体系：
1、适用模型
（1）巨噬细胞（M0、M1、M2亚型）
（2）CD4⁺或CD8⁺ T细胞激活状态比较
（3）DC细胞在病原暴露前后
2、分组建议
（1）Baseline vs 高乳酸处理（乳酸钠/LPS/低氧）
（2）M1 vs M2型极化模型
（3）阴性对照 vs HDAC抑制剂处理组（如TSA、NAM）
百泰派克生物科技可协助客户设定合理的代谢干预剂量与时间点，实现乳酰化变化的可测性与可重复性。
三、样本制备与乳酰化肽段富集
1、蛋白提取
（1）含RIPA裂解液+蛋白酶/脱乳酰化酶抑制剂
（2）低温裂解、超声处理，减少降解
2、肽段酶解
（1）Trypsin/Lys-C双酶体系提高覆盖率
（2）肽段脱盐处理，去除离子干扰
3、富集步骤
（1）使用抗-Kla抗体免疫富集乳酰化肽段
（2）标准化磁珠用量与肽段输入量，确保批间一致
（3）建议结合多轮富集提升检出率
百泰派克生物科技自主优化了抗乳酰化抗体富集体系，可实现单次上样<1mg肽段仍可稳定获得数百个乳酰化位点。
三、DIA-MS质谱采集参数设置
1、仪器推荐
2、DIA参数优化
3、伪DDA库构建策略
百泰派克生物科技已构建人类免疫细胞乳酰化修饰参考数据库，可提升未知乳酰化肽段匹配率。
四、数据分析与乳酰化位点定量
1、数据处理软件
2、定量策略
3、生物信息学分析
百泰派克生物科技可为客户提供位点层级定量矩阵+功能通路图谱+乳酰化调控模型，助力论文高水平发表。
免疫细胞中的乳酰化修饰揭示了代谢-转录-功能耦合的新型表观调控机制。DIA-MS凭借其高重复性、高定量准确性与低样本损耗特性，正成为乳酰化研究中的黄金技术方案。百泰派克生物科技已构建免疫细胞蛋白乳酰化的DIA-MS定量分析全流程解决方案，包括：样本标准化制备流程；高特异性乳酰化肽富集体系；高分辨率DIA-MS分析平台；位点层级定量与富集通路解读。
百泰派克生物科技——生物制品表征，多组学生物质谱检测优质服务商
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