如何确定蛋白全长序列？

确定蛋白全长序列（Full-length protein sequence）是蛋白质研究中的基础工作，尤其在新蛋白功能研究、结构分析、抗体制备及重组表达等场景中尤为重要。那么，科研人员究竟应如何获得一个蛋白质的完整氨基酸序列呢？本文将从技术角度系统梳理，并结合当前主流方法与最新进展，提供实用思路。

 

一、什么是蛋白全长序列？

蛋白全长序列是指从翻译起始位点（对应起始密码子）开始，至终止位点结束，由开放阅读框（ORF）翻译出的完整氨基酸链。这一序列代表一个功能性蛋白质的全部一级结构，是结构与功能研究的基础。

 

二、如何获得蛋白全长序列？——常用方法对比

1、基因水平：从mRNA / cDNA入手

适用于已知或预测蛋白，基于核酸信息推导出蛋白序列。

（1）RT-PCR + Sanger测序

• 流程：提取mRNA → 逆转录为cDNA → 设计特异引物 → PCR扩增全长CDS → Sanger测序验证

• 适用场景：目标蛋白有预测序列（如NCBI/UniProt已有注释）

• 优点：准确度高；可检测剪接变体

• 局限：需要高质量RNA；可能扩不出超长序列

 

（2）RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）

• 功能：补全5' 或 3' 端未覆盖区域，实现全长克隆

• 适用对象：已有部分序列信息但缺失末端

• 推荐策略：结合RT-PCR与RACE使用，获得完整CDS

 

（3）全转录组测序（RNA-Seq）

• 优势：无需已知序列，系统性获取所有转录本

• 分析方法：de novo组装 or 比对注释数据库（如RefSeq）

• 适合场景：非模式物种、新基因发现

 

百泰派克生物科技提供高质量RNA提取与全长转录本测序服务，可协助构建完整的蛋白编码序列（CDS）。

 

2、蛋白水平：基于质谱技术的蛋白序列鉴定

当缺乏cDNA信息或只有蛋白样本时，可采用质谱技术从蛋白层面推断序列。

（1）Edman降解（N端测序）

• 原理：逐步切除并鉴定N端氨基酸

• 限制：只能测前10~30个氨基酸，且要求N端游离

• 适用：验证表达产物N端结构

 

（2）底物酶解 + LC-MS/MS（蛋白质体质谱）

• 步骤：酶解蛋白 → LC-MS/MS分析 → 序列数据库比对

• 拓展策略：de novo测序：用于无数据库时直接预测肽段序列；整合转录组信息：构建蛋白翻译框以提高匹配率

 

百泰派克生物科技配备Orbitrap Exploris等高分辨率质谱平台，支持高覆盖率的蛋白质组检测与拼接分析。

 

3、蛋白序列预测 + 生物信息学工具

当已知DNA或cDNA序列但未翻译成蛋白时，可借助工具进行序列推导与辅助分析：

（1）ORF Finder（NCBI）：寻找开放阅读框

（2）Expasy Translate Tool：将cDNA翻译为氨基酸

（3）SignalP、TMHMM：预测信号肽和跨膜区域，辅助判断全长合理性

（4）AlphaFold2 / ESMFold：结构建模反推序列完整性（间接验证）

 

三、如何判断一个序列是否“全长”？

这是科研中常见问题，判断蛋白全长序列标准可包括：

 



 

在蛋白研究与表达构建过程中，蛋白全长序列的确认是基础但关键的一步。百泰派克生物科技整合高质量RNA提取、cDNA克隆、RACE补全、蛋白质组质谱分析等多种平台手段，为科研客户提供一站式蛋白序列解决方案：

1、全长CDS克隆与测序服务

2、RACE扩增与转录组深度测序

3、蛋白质组质谱鉴定（支持未知序列）

4、表达载体设计与验证

让蛋白不再“残缺”，助力下游研究高效推进。

 

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