蛋白质异构体分析中全长测序的关键策略
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一方面，天然异构体赋予蛋白多样性，是功能调控的基础；
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另一方面，表达过程中产生的非预期异构体，可能影响活性、一致性乃至免疫原性，成为药品质量控制的重大风险。
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使用温和裂解液（如高盐结合非离子去垢剂）；
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添加蛋白酶抑制剂与还原剂（如DTT、TCEP）；
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快速低温提取与纯化流程，减少修饰损失；
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对高复杂度样本（如血浆、组织）采用SEC、CZE等高分辨分离方法，以提高靶向蛋白特异性。
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Orbitrap Eclipse/HF-X系列：具备高扫描速率与高动态范围，适合中高通量异构体筛查；
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FT-ICR MS：以超高分辨率著称，适合解析大分子和复杂修饰形式，但成本与分析时间更高。
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ProSight Lite / PC：用于Proteoform比对与定量；
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TopPIC、MSPathFinder：支持自动化识别未知PTMs及序列偏移；
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DeepTopo等AI算法：引入深度学习模型，提升低丰度异构体的识别能力。
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应用Orbitrap Eclipse Tribrid平台，结合EThcD碎裂模式保留结构细节与修饰；
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自研蛋白保护处理流程，兼容细胞、组织、血浆等多种样本来源；
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搭配自主开发的数据解卷积与异构体识别算法，支持高通量异构体筛查与定量。
从结构微差到功能判定，蛋白质全长测序如何揭示异构体的“隐藏信息”？在蛋白药物、重组酶、抗体工程等大分子生物制品的开发过程中，蛋白质异构体（protein isoforms）的存在常常令人“又爱又怕”：
由于异构体之间可能仅存在1–2个氨基酸的差异，或表现为修饰状态不同、C端延伸等微结构变化，传统蛋白质组学方法在识别和区分这类差异上存在挑战。而蛋白质全长序列测定（de novo full-length protein sequencing）结合无参考拼接策略与高分辨质谱平台，已成为识别与验证蛋白异构体的重要技术路径之一。本文将系统解析，在蛋白异构体分析中，全长测序技术如何通过合理策略实现“精准识别与可靠区分”。
一、全长测序如何助力蛋白质异构体的精确分析？
1、保留完整蛋白信息，避免酶切信息丢失
在传统的bottom-up质谱方法中，蛋白被酶解为多个肽段进行分析，这可能导致蛋白整体结构和共修饰信息的缺失。例如，若一个蛋白同时发生磷酸化和乙酰化修饰，bottom-up分析可能无法判断这些修饰是否位于同一分子上，或属于不同异构体。
而在top-down或pseudo-top-down的全长测序流程中，可将完整或大段蛋白质送入高分辨质谱进行离子化和碎裂，保留修饰、剪接位点和完整序列信息。这一策略有助于实现异构体间的结构差异识别，并支持后续定量分析。
2、能捕捉低丰度且功能关键的异构体形式
某些蛋白异构体仅在特定生理或疾病状态下表达，其丰度远低于主型蛋白。全长测序借助如Orbitrap、FT-ICR等高分辨质谱平台，结合优化的富集和数据处理流程，可在一定程度上实现对这些低丰度异构体的检测。这对于癌症标志物研究和靶向药物开发等领域具有重要意义。
二、实现高质量全长测序的关键技术策略
1、样品处理与蛋白保留策略
蛋白质全长测序对样品完整性要求极高。需避免蛋白降解、变性及修饰丢失。常见策略包括：
2、合理选择质谱平台与碎裂模式
目前主流蛋白全长测序分析依赖以下两类质谱平台：
推荐使用保留修饰能力更强的碎裂模式，如ETD、EThcD、UVPD，以提升异构体识别的覆盖率与准确性。
3、高效数据解卷积与异构体识别算法
异构体结构解析的难点在于：谱图复杂、数据量庞大、修饰类型多样。需依赖高性能算法进行谱图解卷积和序列重建，当前常用工具包括：
三、百泰派克生物科技的全长蛋白质测序平台
百泰派克生物科技搭建了专注于蛋白异构体研究的全长测序技术平台，提供从样本处理到数据解读的端到端服务：
我们的服务已广泛应用于生物标志物开发、PTM研究、蛋白结构功能研究等多个领域，为基础科研与临床转化提供坚实的质谱支撑。
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