圆二色性（CD）光谱分析原理与实验设计

圆二色性（Circular Dichroism，CD）光谱是一种基于手性分子对圆偏振光吸收差异的光谱技术，广泛应用于研究蛋白质、核酸等生物大分子的构象特征。本文将介绍圆二色性（CD）光谱分析的原理、实验设计要点以及其在生命科学研究中的核心价值。

 

一、CD光谱原理概述

CD光谱的本质是手性分子对左旋和右旋圆偏振光吸收不同所产生的光学现象。具体而言，生物大分子天然具有手性结构，当圆偏振光穿过这些分子时，会对左右旋分量产生不同程度的吸收，形成吸收差值（ΔA），即：

ΔA = A_L - A_R

其中，A_L 表示对左旋圆偏振光的吸收，A_R 表示对右旋圆偏振光的吸收。

不同波段的CD信号反映了分子结构的不同层面：

• 远紫外区（190–250 nm）：揭示蛋白质和核酸的二级结构；

• 近紫外区（250–350 nm）：反映芳香族侧链及其空间构象；

• 可见光区（>350 nm）：用于研究金属配位环境或色素结合蛋白。

CD信号的强弱常用“椭圆度”（theta，单位为 mdeg）或“摩尔椭圆度”（[theta]）进行定量描述，用于表征分子的构象特征。

 

二、圆二色性（CD）光谱分析实验设计要点

CD光谱实验对样品状态和光学参数敏感，科学的实验设计是确保数据可解释性和可重复性的基础。

1、样品准备

※ 浓度建议：

• 远紫外分析：蛋白质浓度建议控制在 0.1–0.5 mg/mL；

• 近紫外分析：建议浓度在 1 mg/mL 以上；

 

※ 缓冲液选择：

• 避免含有强吸收成分（如Tris、DTT、咪唑等）；

• 推荐使用低吸收缓冲体系，如磷酸盐或醋酸盐；

 

※ 其他注意事项：

• 过滤或离心样品去除颗粒物，避免光散射；

• 保证样品纯度 ≥95%，降低背景干扰。

 

2、光程与比色皿选型

• 远紫外区：建议使用 0.1–0.2 mm 石英比色皿；

• 近紫外区及可见光区：可使用 1–10 mm 比色皿；

• 使用前需彻底清洗比色皿，保持透明无划痕。

 

3、光谱采集设置

• 波长范围：依据实验目的选择，如远紫外一般为 190–260 nm；

• 扫描速度：20–50 nm/min；

• 带宽设定：1 nm 为常规推荐；

• 扫描次数：至少重复 3 次取平均值以增强信噪比；

• 温控设置：必要时使用温控附件进行恒温或变温实验，以分析结构稳定性。

 

三、数据处理与结构分析

实验数据通常需进行背景扣除和单位换算，进一步用于定量分析蛋白质的二级结构组成。

摩尔椭圆度计算公式如下：

[theta] = (theta_obs × 100) ÷ (c × l × n)

其中：

• theta_obs：观测椭圆度，单位为 mdeg；

• c：样品浓度，单位 mol/L；

• l：光程长度，单位 cm；

• n：肽键数（对于蛋白质样本来说）。

经过单位换算后得到的摩尔椭圆度，可用于与参考数据库谱图比对，并通过拟合软件（如CONTIN或CDSSTR算法）估算蛋白质中 α-螺旋、β-折叠、无规卷曲等二级结构的相对比例。此外，通过变温扫描可绘制热变性曲线，计算蛋白质熔解温度（Tm），用于评价其稳定性。

 

四、圆二色性（CD）光谱分析技术的典型应用方向

CD光谱作为一种快速、非破坏性的结构分析手段，在基础研究与应用开发中均具有广泛价值：

• 研究蛋白质的二级结构与构象变化；

• 对比不同条件（pH、温度、离子强度）下蛋白构象变化；

• 分析蛋白质突变体与野生型的结构差异；

• 研究蛋白-小分子或蛋白-核酸的结合效应；

• 在疫苗、抗体等生物制剂开发中评估产品的一致性和稳定性。

 

圆二色性（CD）光谱分析作为研究生物大分子结构的重要工具，具备操作简便、信息丰富、结果直观等多重优势。通过科学设计实验流程与精准分析数据，研究者可深入理解蛋白质构象动态及其与功能的关系。百泰派克生物科技具备专业的圆二色性光谱分析平台，结合多组学技术（包括质谱、热稳定分析、分子互作测定等），为科研用户与生物医药企业提供精准的结构生物学解决方案。

 

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