iTRAQ标签技术如何用于肽组学分析？
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细胞/组织：使用冷PBS清洗，避免蛋白降解
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体液样本：加入蛋白酶抑制剂，尽快离心除去细胞碎片
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内源肽组学研究：采用分子量截留（<10 kDa）、固相萃取或C18磁珠富集
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可控酶解策略（如酶解短肽组）：适用于结合蛋白表达调控与功能片段研究
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报告基团（Reporter group）：在MS/MS中释放出可识别的离子（如114、115、116等）
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平衡基团（Balance group）：调节标签质量，总质量相同
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反应基团（Reactive group）：与肽段N-末端和赖氨酸侧链共价结合
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定量上样：每个样本严格定量至相同肽段总量（建议100 µg以上）
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干燥重悬：用iTRAQ专用缓冲液重悬，避免使用含氨缓冲液（如Tris）
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标签反应：加入各自的iTRAQ试剂，在37℃反应1-2小时
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反应终止：加入去反应液抑制残余iTRAQ活性
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样本混合：所有标签组分按照1:1比例混合，混合后统一进入后续处理
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C18 SPE固相萃取柱：去除盐离子、标签副产物等干扰物
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磁珠富集（可选）：进一步集中目标分子量段的肽段
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使用高pH反相液相色谱（High-pH RPLC）对混合样本进行预分离
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将混合样本拆分为多个组分（如8~12组），降低复杂度，提高肽段识别数量
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纳升级液相色谱系统（nanoLC）+ 高分辨质谱平台（如Orbitrap Exploris 480）
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MS/MS模式采用 HCD碎裂，可准确释放iTRAQ报告离子
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常用DDA模式进行肽段鉴定与定量
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可扩展至DIA、PRM模式以增强重复性与靶向验证能力
在肽组学分析中，质谱技术通常用于识别样本中天然存在的内源性肽段。然而，仅靠“是否存在”远远不足以揭示疾病机制或发现生物标志物。定量分析，尤其是多样本之间的差异表达比较，是理解病理变化、寻找潜在靶点的关键。iTRAQ标签技术（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification），不仅广泛应用于蛋白组学，在特定肽组学研究中也正发挥重要作用。
一、什么是iTRAQ标签技术？原理与优势简析
iTRAQ是一种基于等重同位素标记的多通道相对定量技术，通过将不同样本的肽段打上“质量相同但碎裂后可区分”的标签，使得多个样本可在同一次质谱分析中并行比对、定量分析。
1、iTRAQ技术核心特点：
（1）多重标签：支持4-plex、8-plex，最多可实现8组样本并行分析
（2）等质量标记：标签本身不影响色谱分离或MS1质量数峰
（3）MS/MS级定量：在二级质谱中释放出各标签特有的报告离子，用于相对定量
百泰派克生物科技常用的iTRAQ 8-plex平台，适用于比较多个样本组（如疾病亚型、干预前后、生理状态差异）下的肽段表达谱，为高通量筛选提供高效工具。
二、实验流程详解：iTRAQ标签技术在肽组学分析中的标准操作路径
1、样本收集与总蛋白/肽段提取
根据研究目标和样本类型（组织、血清、尿液、脑脊液等），选择不同的肽段提取策略：
（1）样本来源
（2）肽段提取方法
所有操作均在低温/保护环境下进行，以最大限度保持肽段结构与修饰状态。
2、iTRAQ标签标记
（1）标签原理
每种iTRAQ标签包含三个部分：
（2）标记流程
若富集前进行标记操作，则需确保肽段N末端未被封闭或修饰，保证标签结合效率。
3、清洗、分级与样品处理
为了降低样本复杂度、提高质谱灵敏度，通常在质谱分析前进行如下步骤：
（1）清洗步骤
（2）分级策略（推荐）
4、LC-MS/MS质谱分析
（1）分析平台
（2）采集策略
5、数据解析与定量分析
百泰派克使用专业软件与自建数据库，进行以下关键分析步骤：
（1）肽段鉴定
使用如Proteome Discoverer、MaxQuant、PEAKS等软件比对MS/MS谱图
支持UniProt、RefSeq、Ensembl等数据库对接
（2）标签离子强度提取
提取每个肽段的iTRAQ报告离子峰强，计算相对丰度比值
扣除背景噪声与标签泄漏（cross-talk）影响
（3）统计分析
差异肽段筛选（Fold Change、p值、FDR）
热图、PCA、聚类、火山图可视化表达谱
（4）功能富集与通路注释
将差异肽段回溯至来源蛋白，结合GO、KEGG、Reactome通路分析
可支持后续验证标志物预测、机制解析等需求
三、iTRAQ标签技术能否用于肽组学分析？——答案是“有条件地可以”
iTRAQ主要用于蛋白组学中的酶解肽段分析，但在特定肽组学研究中，iTRAQ也可用于对内源性肽段进行定量。其适用范围主要包括以下几类研究：
1、小分子内源肽段差异表达分析
如神经肽、激素肽、免疫相关调节肽等，这些天然存在的短肽可被直接标记，比较不同处理组下的表达变化。
2、富集肽段组分的定量研究
通过分子量截留、磁珠富集等方法预处理后获取的肽段混合物，更适合iTRAQ标签标记和定量，尤其在液体活检中常见。
3、药物干预、疾病模型中肽段响应分析
例如研究药物诱导下肽段水平变化，评估肽段是否可能为药物作用靶点或下游应答产物。
四、iTRAQ标签技术在肽组学分析中的优势与局限
1、优势
（1）定量精确：不同样本数据直接来自同一次质谱扫描，避免批次误差
（2）通量高：一次实验支持多组样本，节省成本与时间
（3）可联合蛋白组数据：方便与传统iTRAQ蛋白组数据进行整合分析，构建“蛋白-肽段”调控图谱
（4）适用于液体样本：如血清、尿液、脑脊液中的内源肽段分析，适配性强
2、局限
（1）对极短肽段适用性较差：肽段过短或缺乏标记位点（如N末端氨基或赖氨酸）会影响标签接入
（2）标记效率要求高：若标记不完全会干扰定量准确性
（3）不适用于全HLA肽组学：因HLA肽段需保持原始结构，iTRAQ标记有可能改变其构象或影响亲和验证
在需要多组样本平行定量、研究内源肽段表达差异的场景中，iTRAQ标签技术依然具备重要价值。通过合理设计实验流程和优化前处理策略，iTRAQ可以成为肽组学分析中有力的“定量引擎”。百泰派克生物科技将持续完善质谱平台与标签策略，为科研人员提供可靠、高效、精准的肽组学定量解决方案，助力更深入的生物标志物发现与机制探索。
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