无标记定量肽组学：探索样本中肽的真实表达量
“无标记定量肽组学”（Label-Free Quantitative Peptidomics, LFQ）是一种利用质谱技术进行蛋白质/肽段定量的方法，通过该方法能有效探索样本中肽的真实表达量，具有无需引入同位素或化学标签的优势，适用于高通量、低成本、多样本的生物学研究，它通过测量肽段在质谱中的信号强度或谱图数量，间接推算其在样本中的相对丰度的定量方法。不同于 SILAC、TMT 等标签技术，LFQ 不依赖任何外源标记，适用于更广泛的样本类型和研究场景。标签方法（如 SILAC、TMT、iTRAQ）虽广受欢迎，但成本高、实验流程复杂。相比之下，“无标记定量肽组学”以其无需化学标签、成本更低、操作更灵活的优势，越来越多地被科研团队和生物医药企业采用。
一、无标记定量肽组学的主流定量方法
1、基于离子强度（Intensity‑Based LFQ）
利用 MS1 峰面积（Area Under the Curve, AUC）或峰强度与肽浓度呈线性相关性进行定量。依托高分辨质谱（如 Orbitrap、FT‑ICR），可覆盖 2‑3 个数量级的动态范围，非常适合检测低丰度蛋白。
2、基于谱图计数（Spectral‑Counting）
统计 MS2 的触发次数，认为捕获次数与蛋白丰度成正比。方法直观易实现，但对低丰度肽灵敏度相对较低，线性范围较窄。
近年来，“数据独立采集（DIA）”技术融合强度和谱图数据优势，实现高覆盖、低漏检的无标记定量，成为行业趋势。
二、无标记定量肽组学技术流程详解
1、样本制备
从组织、细胞或生物液体（血清、尿液等）中提取蛋白质，经胰蛋白酶酶解生成肽段。LFQ 跳过化学标签步骤，流程更简洁，通用性更强。
2、LC‑MS/MS 分析
（1）使用高性能液相色谱分离肽段
（2）采用 DDA 或 DIA 模式采集 MS 数据
（3）DIA 模式下，采集覆盖所有 m/z 区间，可极大提高定量覆盖度和重现性
3、定量处理
（1）结合专业软件（如 MaxQuant、OpenMS、Proteome Discoverer），完成峰提取、保留时间对齐与强度标准化
（2）通过对照样本、内标或归一化方法修正技术误差
4、差异统计分析
（1）实施 t‑检验、ANOVA、多重假设校正
（2）构建 Volcano 图、热图等可视化结果，引导下游生物学解读
5、生物验证阶段
核心肽段或差异蛋白进一步使用 PRM（Parallel Reaction Monitoring）、WB（Western Blot）、ELISA 等手段验证，增强结果可信度。
三、无标记定量肽组学优势一览
1、高通量、极具灵活性：无需标签合成，批次少，适合进行大样本、高重复实验。
2、显著成本优势：省去昂贵的同位素试剂，实验成本下降约 30–50%，适合科研或企业预算受限情况。
3、动态范围宽³ 个数量级：卓越的检测潜力适合探索复杂样本中的低丰度肽。
4、实验随需增样：自由扩充样本量，频繁用于探索性研究、临床队列、药效筛检等场景。
5、兼容多种样本类型：适用于 FFPE、血清、组织、细胞系等多种生物样本，无“标签兼容”困扰。
四、挑战与局限
1、批次重现性问题：各批次实验独立，仪器漂移增加变异，需通过内标或批次校正策略控制噪声。
2、低丰度肽敏感性不足：在复杂背景中弱信号可能难以被 MS 探测，需优化 LC 梯度与质谱参数。
3、数据处理繁重：高通量产出 PB 级数据，缺失值填补、对齐和滤除冗余流程复杂。
4、定量精度略逊于标签法：与 SILAC、TMT 等方法相比，无标记 LFQ 有时精度略低，但工具和算法正在缩小这一差距。
五、应用场景：科研实践与产业落地
1、生物标志物发现
通过 LFQ 对比疾病 vs 健康样本，筛选潜在生物标志物（oncoproteins、炎症指标等），再结合 PRM 验证以提高可信度。
2、药物作用机制研究
药物处理后细胞或动物模型中定量对比蛋白表达变化，解析信号通路和机制预测。
3、质量控制与批次一致性监测
制药领域用于疫苗、重组蛋白生产中宿主蛋白（HCP）监控，保障生物制品安全性和稳定性。
4、环境与代谢应答研究
用于植物、微生物、动物模型在外界应激、药物、化合物干预后的蛋白组响应监测，助力代谢机制解析。
六、新兴趋势与前沿突破
1、nDIA（窄带宽 DIA）技术：兼顾覆盖深度与采样速度，可实现 15–30 分钟 LC 梯度高通量分析。
2、DirectLFQ 等高阶归一化算法：通过自动化归一化、大规模批次标准校正，提高信号精度。
3、单细胞蛋白组 LFQ：借助 nano-LC 与高灵敏 MS，逐步拓展至单细胞层面的表达测序。
4、标准化社区推动：如 HUPO-PSI 标准格式（mzML、mzTab）促进数据互通与公开共享。
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