福林酚法测定蛋白含量标准曲线制作
福林酚法是测定蛋白含量常用的方法。使用福林酚法测定样品中目标蛋白的含量时,需要先建构一系列已知浓度梯度的蛋白溶液,然后通过分光光度法(600 nm)测量这些蛋白溶液的吸光度值,根据测得的吸光度值与对应浓度构建标准曲线,由于吸光度与蛋白质含量成线性关系,再测定未知浓度的蛋白溶液的吸光度值,就可以将吸光度值带入标准曲线计算出目的蛋白的含量。下面介绍福林酚法测定蛋白浓度时标准曲线的制作过程。
福林酚法测定蛋白浓度标准曲线图的制作
1、试剂与材料
● 标准蛋白溶液(100μg/mL):纯牛血清血蛋白(BSA),预先测定蛋白含量,根据其纯度用蒸馏水配制成100μg/mL蛋白溶液。
● 福林酚试剂甲:吸取试剂A(0.2M 氢氧化钠与4%无水碳酸钠溶液等体积混合)100 mL,加入试剂B(2% 酒石酸钾钠溶液与1% 五水硫酸铜等体积混合)2 mL混合而成。
● 福林酚试剂乙:在2 L的磨口回流装置中加入100 g 二水钨酸钠,25 g 二水钼酸钠,700 mL 水,再加50 mL 85%磷酸及100 mL 浓盐酸,充分混合后,以小火回流10 h。再加入150 g 硫酸锂,50 mL 水及数滴液溴,然后开口继续沸腾15 min,以便驱除过量的溴。冷却后定容成1 L。过滤,置棕色瓶中,保存在冰箱中。使用时用氢氧化钠标准滴定溶液滴定,以酚酞做指示剂,而后适当稀释(约1倍),使最后浓度为1mol/L H⁺(1N 酸),此即为Folin-酚试剂乙。
● 分光光度计
2、标准曲线制备
3、标准曲线的绘制
以OD600 nm为纵坐标,标准蛋白(BSA)含量为横坐标,在坐标轴上绘制标准曲线
● 利用Excel中标准曲线查出线性回归方程
● 用公式计算线性回归方程
● 用origin作图 ,得出线性回归方程
4、注意事项
● 回归方程公式为OD600 nm = aX+b,一般相关系数(a)应过0.999以上,至少要在2个9以上
● 绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧
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