BCA法测定蛋白浓度

蛋白的定量分析在蛋白质组学、营养功能、生理代谢等研究领域有非常重要的作用。用于蛋白定量的方法有很多，常用的方法包括双缩尿法、福林-酚法（Lowry）、考马斯亮蓝法（ Bradford）、二喹啉甲酸（BCA）法、凯氏定氮法等。这些方法的原理不同，所受的影响因素也各不相同。因此，不同的方法其优点和局限性不同，在定量分析蛋白时要选择适宜的方法。下面介绍用BCA法测定蛋白浓度的相关信息。

 

一、BCA法测定蛋白浓度的原理

BCA（Bicinchoninic acid）也叫2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠，是一种化学试剂。BCA 法测定蛋白浓度原理为蛋白质将BCA中二价铜离子还原成亚铜离子，后者在碱性条件下与 BCA 络合生成紫红色络合物（图1）。该化合物在 540 ～ 590 nm 内有最大吸收波长，反应物的颜色和蛋白浓度在一定范围内具有线性关系。

 

图1. BCA法测定蛋白浓度的原理图

 

二、BCA法测定蛋白浓度的步骤流程

实验步骤：

1、标准品稀释：取10μLBSA标准品用PBS稀释至100μL，使终浓度为0.5 mg/mL。将标准品按0，2，4，6，8，12，16，20μL加到96孔板的蛋白标准品孔中，各孔加PBS补足至20μL。

 

2、样品稀释：将样品作适当稀释，加20μL到96孔板的样品孔中。

 

3、工作液配制：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。

 

4、含量测定：各孔加入200μL BCA工作液，盖上96孔板板盖，于37°C放置15-30 min。用酶标仪测定A₅₆₂ nm。将各稀释浓度标准品的A₅₆₂ nm处数据导入Excel，做散点图，得出标准曲线公式，根据标准曲线公式计算出未知蛋白的浓度。

 

图2. BCA法测定蛋白浓度的流程步骤图

 

三、BCA法测定蛋白浓度的优缺点

优点：法试剂配制简单、操作方便、反应产物稳定、检测灵敏度高、线性范围宽，受蛋白标准品的影响较小。BCA法对 NaCl、NaOH 和 SDS 等蛋白提取溶剂有一定的耐受性，是优越的蛋白定量分析方法之一操作简便快速，只需加一种染液，适合于大批量样品蛋白质含量的测定。

 

缺点：可能会受螯合剂（EDTA、EGTA）和高浓度还原剂（DTT、β-巯基乙醇）的影响。

 

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