蛋白热稳定性分析

蛋白质的热稳定性是指蛋白质多肽链在温度影响下的形变能力，主要体现在温度改变时多肽链独特的化学特性和空间构象的变化，形变越小热稳定性越高。在生物技术、药物研发以及食品工业等领域，蛋白热稳定性分析均具有重要意义。蛋白质的热稳定性一般使用热变性中点温度（Tm）来表示，即蛋白质解折叠50% 时的温度。测定蛋白质Tm值的常用方法有以下几种：

• 圆二色谱法（CD）：CD是蛋白质结构研究中广泛应用的方法，其原理是蛋白质对左旋和右旋圆偏振光的吸收存在差异，利用远紫外区（190~260nm）的光谱特征能够快速分析出溶液中蛋白质的二级结构，进而分析和辨别出蛋白质的三级结构类型，此外，通过测定蛋白质在不同温度下的平均残基摩尔椭圆度[θ]可以获得蛋白质的Tm。

特点：适用于测定稀释溶液的热稳定性，溶液浓度过高蛋白质分子间相互作用可能会使结果不准确；操作相对简单，成本较低。

• 差示扫描量热法（DSC）：通过对参照物和样品同时进行升温或冷却处理，测定两者为保持相同温度所产生的热量差，从而计算蛋白质的Tm值。

特点：能够提供直接的热量变化数据，定量准确、操作简便；但检测通量低、耗时较长。

• 差示扫描荧光（DSF）：也被称为热荧光法。根据荧光源不同分为基于内源染料荧光的DSF和基于外源性荧光的DSF。

• 基于内源性荧光的DSF：其原理主要基于蛋白质中特定氨基酸（如色氨酸和酪氨酸）的荧光特性。这些氨基酸的荧光强度与其所处的微环境密切相关，因此，当蛋白质的结构发生变化时，这些氨基酸的荧光信号也会随之改变。

特点：无需复杂的样品处理或标记步骤，实验相对简便；但不是所有蛋白质都含有足够的荧光基团，且可能会受其他基团影响。

• 基于外源染料荧光的DSF：其原理是利用能与蛋白内部疏水基团相互作用的染料为荧光源。蛋白质加热变性后疏水基团暴露，疏水基团与亲和性染料结合产生荧光信号，仪器监测荧光强度变化测定Tm值。

特点：适用于高通量筛选，信号强度可控，灵敏度和准确性都较高；但添加的外源染料可能会对蛋白质结构和功能产生影响，且操作较复杂。

表1 蛋白质热稳定性分析方法对比

除了上述方法，还有一些其他的分析方法，如超速离心分散沉积法、PCR仪加热法等，这些方法各有特定的适用范围和局限性，因此在实际应用中需要综合考虑多种因素，选择最适合的方法来进行蛋白质热稳定性的分析。

百泰派克生物科技（BTP）配备Malvern Panalytical公司的MicroCal VP-Capillary DSC系统，可高效、精准的对生物制品的热稳定性进行分析。此外，该自动化、集成式高通量平台还可以应用于鉴定和筛选生物药物、配体间相互作用等研究，欢迎您的咨询。

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