基于质谱的定量蛋白质组学
定量蛋白质组学的核心是利用质谱（MS）在不同实验条件下准确测量蛋白质的丰度。质谱的高分辨率和高灵敏度可以精确量化蛋白质的表达水平，结合一些定量方法还可以同时分析多个样本。最常用的策略包括非标记定量和标记定量。
一、非标记定量蛋白质组学
非标记定量是指不依赖任何化学或同位素标记的定量方法。蛋白质丰度是通过肽段的信号强度或谱计数来计算的。常用的非标记定量方法包括基于信号强度的定量和谱计数。
1、基于信号强度的定量
基于信号强度的定量通过测量质谱仪中检测到的肽离子的强度来进行定量，假设肽离子的强度与其丰度成正比。在这种方法中，蛋白质经过酶解变为肽段，通过液相色谱分离，并用质谱进行分析。每个肽段的信号强度反映了其相对丰度，随后用于估算样本之间蛋白质表达的变化。这种方法简单、成本效益高，适合大规模和复杂样本的分析。然而，信号强度的准确性可能会受到离子化效率和样本复杂度差异的影响。
2、谱计数
谱计数通过统计每个蛋白质匹配到的MS/MS谱图的数量来估算蛋白质丰度。在质谱分析过程中，蛋白质被消化成肽段，这些肽段被碎裂并以谱图的形式检测。每个蛋白质的谱图数量与其丰度成正比。谱计数方法简单且具有高通量，常用于相对定量。然而，它存在一些限制：对离子化效率敏感，对低丰度蛋白质的准确性较差，且无法提供绝对定量。此外，其准确性高度依赖于参考数据库的完整性。
图1. 非标记定量蛋白质组学工作流程
3、4D非标记定量蛋白质组学
4D非标记定量蛋白质组学将离子迁移谱（IM）和数据独立采集（DIA）技术结合，用于高分辨率、高通量的蛋白质定量。该方法整合了四维分离—保留时间、质荷比（m/z）、离子强度和离子迁移性—提高了选择性和分辨率。通常在像Bruker timsTOF Pro这类仪器上使用diaPASEF（平行积累–串行碎裂）采集方法。工作流程包括蛋白质提取、酶解、液相色谱分离、离子迁移分离、质谱检测以及下游生物信息学分析。该方法不需要任何标记，因此适用于多种生物样本类型。
Jiang, H. et al. BMC Pregnancy and Childbirth, 2024.
图2. 4D非标记定量蛋白质组学工作流程
4D非标记定量蛋白质组学显著提高了低丰度蛋白质和结构相似肽段的识别，改进了定量的准确性，并增加了重复性。其非标记特性确保了更低的成本和更简便的工作流程，适用于大规模研究。然而，这一方法需要特定的仪器和强大的数据分析能力，并且在批次间比较方面可能不如TMT或iTRAQ有效。它更适合深入的基础研究和动态蛋白质组谱分析，而不是标准化的临床应用。
二、标记定量蛋白质组学
在讨论完非标记定量的优势和挑战后，我们接下来探讨标记定量策略。标记定量依赖化学或同位素标签来量化蛋白质丰度。这些策略通常提供更高的准确性，非常适合多个样本之间的比较分析。
1、SILAC（细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记）
SILAC是一种代谢标记技术，通过向培养细胞中添加稳定同位素标记的氨基酸，在合成过程中标记蛋白质。通过在细胞培养基中补充同位素标记的赖氨酸或精氨酸（如15N标记），蛋白质自然地将这些标签纳入其中。酶解后标记和未标记的肽段可以通过它们在质谱中的质量差异进行区分。SILAC能够实现高度准确的定量，并且在分析复杂生物基质中的低丰度蛋白质时特别有用。
Chen, X. et al. Proteomics, 2015.
图3. SILAC定量蛋白质组学工作流程
SILAC具有高灵敏度和精度，广泛适用于各种生物学模型。然而，它也有一些限制，比如试剂成本较高，且需要高性能的质谱平台和数据处理能力。
2、iTRAQ（同位素标记相对和绝对定量）
iTRAQ是一种化学标记技术，使用同位素标签进行多个样本中蛋白质的相对和绝对定量。每个iTRAQ标签包含一个报告基团和一个反应基团。在质谱/质谱分析过程中，标签碎裂并释放出独特的报告离子，这些报告离子的强度反映了来自不同样本的肽段的丰度。iTRAQ允许在一次运行中同时分析多达8个样本，从而显著提高通量。
图4. iTRAQ标签结构
iTRAQ因其一致的MS1质量值和独特的MS2报告离子进行定量，提供了高准确性和重复性。它广泛用于疾病研究、药物开发和生物标志物发现。然而，iTRAQ的成本较高，并且在复杂样本中可能会受到报告离子干扰，影响定量精度。正确的标记和样本准备对可靠结果至关重要。
3、TMT（串联质谱标签）
TMT是另一种同位素标记技术，用于相对定量。它通过相同质量的标签标记来自不同样本的肽段。在MS/MS碎裂过程中，这些标签释放出独特的报告离子，使得可以基于离子强度进行定量。与iTRAQ类似，TMT提供准确且可重复的相对定量，适用于多个样本的比较分析。
图5. 10-plex TMT蛋白相对定量工作流程
TMT使得最多可以同时分析16至18个样本（TMTpro），非常适合大规模的比较研究。它提供高精度和改进的数据一致性。然而，TMT试剂的成本和样本处理的复杂性是潜在的限制因素。报告离子之间的干扰可能发生，尤其是在高度复杂的样本中，这可能会影响定量准确性。
总结
定量蛋白质组学已成为现代生命科学中不可或缺的工具，支持基础研究、临床诊断和药物开发的突破。无论是标记定量还是非标记定量策略，都有其独特的优势和挑战，选择合适的方法对于研究的准确性和效率至关重要。随着技术的不断发展，定量蛋白质组学将在精准医疗和生物标志物发现中发挥越来越重要的作用。
作为专注于蛋白质组学领域的科研服务平台，百泰派克生物科技将持续关注定量蛋白质组学技术的发展动态，结合先进平台和专业团队，为科研人员提供更高质量的内容解读与实用服务，共同推动蛋白质组学在生命科学中的创新与应用。
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