单细胞亚硫酸氢盐测序
单细胞亚硫酸氢盐测序（Single-cell bisulfite sequencing）是一种用于解析单个细胞DNA甲基化状态的高通量测序技术。该技术结合了亚硫酸氢盐处理与单细胞分离及高通量测序手段，能够在单细胞分辨率下揭示全基因组范围内的5-甲基胞嘧啶（5mC）分布。DNA甲基化作为表观遗传调控的机制，广泛参与细胞命运决定、胚胎发育、基因表达调节、肿瘤发生以及免疫应答等关键生命过程。而传统的甲基化测序方法通常基于细胞群体平均信号，无法准确反映细胞间的表观异质性。单细胞亚硫酸氢盐测序的出现使研究者能够在更精细的层级上解析个体细胞的表观遗传图谱，从而推动对发育、疾病及组织复杂性的深入理解。作为当前表观遗传学前沿的重要工具之一，单细胞亚硫酸氢盐测序不仅为基础研究提供了关键数据支持，也在肿瘤异质性评估、干细胞谱系追踪以及免疫细胞功能分型等多个应用领域展现出强大潜力。尽管单细胞亚硫酸氢盐测序提供了前所未有的表观信息分辨力，但其仍面临技术壁垒与应用挑战。一方面，亚硫酸氢盐处理过程对DNA降解敏感，造成信息丢失，需通过改进化学处理方法和文库构建策略加以优化。另一方面，高通量测序成本和数据计算负担限制了其在大规模临床样本中的普及。未来的发展方向包括低损耗甲基化转化方法、高效文库扩增技术以及更具生物学解释力的算法模型，推动单细胞亚硫酸氢盐测序向更高分辨率、更低成本、更广应用场景拓展。
单细胞亚硫酸氢盐测序的核心原理依赖于亚硫酸氢盐对DNA的特异性化学修饰作用。该反应可将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），在后续PCR扩增中被读为胸腺嘧啶（T），而甲基化的胞嘧啶（5mC）在反应中则保持不变。通过比较测序读取的C/T比对信息，研究者可准确判断每个位点的甲基化状态。由于单个细胞中DNA含量极少（仅约6 pg），单细胞亚硫酸氢盐测序对样品损失极其敏感，因而对实验流程的优化提出了极高要求。样品裂解、DNA纯化、亚硫酸氢盐处理、文库构建和扩增等每一步均需精准控制，以避免信息丢失和偏倚，确保甲基化信号的真实反映。
在具体实验策略上，单细胞亚硫酸氢盐测序目前主要分为两类：基于全基因组测序（scWGBS）和目标区域富集测序（scRRBS或scBS-seq）。全基因组方法可实现最全面的甲基化覆盖，但测序成本高、信号稀疏，适用于探索性研究；而富集策略则集中分析CpG岛区域或功能相关基因区域，具备更高的数据密度与信号深度，适用于定向研究或大规模样本筛选。无论采用何种策略，单细胞亚硫酸氢盐测序在数据分析阶段都需面对高缺失率、测序偏倚和细胞间变异等问题，需结合特定生物信息学算法进行降噪、聚类、可视化与功能注释等深度解析。
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