下拉实验
下拉实验（Pull-Down Assay）是一种用于研究蛋白质相互作用的生化技术，该技术广泛应用于分子生物学、细胞生物学以及生物医学研究领域。下拉实验的基本原理是利用融合蛋白的亲和标签及其对应的固定化配体进行特异性结合。研究者首先需要制备带有特定亲和标签的诱饵蛋白，并利用固相亲和基质将其固定。常见的标签系统包括 GST（谷胱甘肽-S-转移酶）-谷胱甘肽琼脂糖珠、His（多组氨酸）-Ni²⁺ 亲和树脂、Biotin（生物素）-链霉亲和素体系等。实验过程中，将待测的猎物蛋白或细胞裂解液加入体系，使其与诱饵蛋白结合，经过适当孵育后，通过严格的洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白，最终使用 SDS-PAGE 和 Western Blot 等方法检测结合蛋白的存在，从而验证蛋白间的相互作用。尽管下拉实验具有较高的特异性和可重复性，但其也存在一定的局限性。例如，体外体系可能无法完全模拟细胞内的生理环境，导致某些弱相互作用难以检测。此外，融合标签可能影响蛋白的天然构象进而影响互作效率。因此，在实验设计时，通常需要结合其他互作验证方法，如 Co-IP、表面等离子体共振（SPR）或荧光共振能量转移（FRET），以确保实验结果的可靠性。
根据实验目的和蛋白性质，下拉实验可分为以下几类：
1、GST 下拉实验（GST Pull-Down Assay）
该方法利用 GST 作为融合标签，常用于筛选与目标蛋白相互作用的伴侣蛋白。GST-融合蛋白可在大肠杆菌等表达系统中表达并通过谷胱甘肽琼脂糖珠固定后进行蛋白互作研究。该方法的优点是标签不会影响蛋白折叠，同时 GST 融合蛋白可以保持较好的溶解性，提高实验成功率。
2、His 下拉实验（His Pull-Down Assay）
适用于研究 His-标签蛋白的互作，尤其是金属依赖性蛋白。该方法通常使用 Ni²⁺ 亲和树脂捕获 His-标签蛋白，再通过洗脱或直接孵育检测互作蛋白。其优点是适用于较高盐浓度条件，有助于减少非特异性结合。
3、生物素-链霉亲和素下拉实验（Biotin-Streptavidin Pull-Down Assay）
由于生物素与链霉亲和素之间的结合力极强（Kd ≈ 10⁻¹⁵ M），这一系统可以用于检测低丰度蛋白或低亲和力的相互作用蛋白。该方法的优势在于高灵敏度和特异性，但也需要注意避免背景噪声的干扰。
4、抗体介导的下拉实验（Co-Pull-Down Assay）
该方法使用抗体偶联磁珠（如 Protein A/G 磁珠）结合特定抗体以拉取蛋白复合物。与共免疫沉淀（Co-IP）类似，但通常在体外进行，适用于重组蛋白的互作研究。
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