基于LC-MS/MS的免疫肽组学分析工作流程详解
- 肿瘤相关抗原（TAA）
- 肿瘤特异性新抗原（Neoantigen）
- 病原体源性抗原（如病毒、细菌）
- 自身抗原（与自身免疫疾病相关）
随着免疫治疗成为肿瘤、病毒感染和自身免疫疾病干预的研究热点，人类对抗原呈递机制的认知也不断深入。在此背景下，免疫肽组学（Immunopeptidomics）应运而生，成为连接分子组学与免疫学之间的关键桥梁。该技术致力于全面识别由主要组织相容性复合体（MHC）分子呈递至细胞表面的肽段集合，这些肽段可以直接被T细胞识别并触发免疫反应。因此，免疫肽组学不仅在新型疫苗的开发中具有广阔前景，也为个体化癌症免疫疗法提供了可靠的抗原筛选依据。基于LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）的免疫肽组学分析技术，能够在实际生物样本中直接检测MHC分子所呈递的肽段，因此被视为当前研究抗原呈递机制最直接、最可信的技术路径。本文将系统梳理基于LC-MS/MS的免疫肽组学分析流程，从样本制备到质谱检测，再到数据解析，帮助科研人员深入理解这一前沿技术的实施要点与应用价值。
一、免疫肽组学的基本原理与研究对象
免疫肽组学的研究对象为由MHC-I或MHC-II分子呈递的内源性肽段。这些肽段来源于细胞内蛋白质的降解产物，反映了细胞的分子状态，包括癌变、感染或应激等。MHC-I主要呈递来自胞内的8–11个氨基酸的短肽，用于激活CD8+ T细胞，而MHC-II则负责呈递更长的肽段（13–25个氨基酸），激活CD4+ T细胞。
研究重点通常包括：
这些肽段是开发个体化疫苗、TCR-T疗法以及靶向治疗策略的核心依据。
二、基于LC-MS/MS的免疫肽组学完整实验流程
免疫肽组学实验面临的最大挑战是目标肽段的低丰度、高复杂性。因此，需要在实验设计上高度优化，以提高检测灵敏度和数据质量。
1、样本准备
常用的样本包括癌细胞系、患者肿瘤组织、PBMC、HLA转染细胞等。由于MHC呈递的肽段数量稀少，通常需要上亿级细胞量或等效组织量，以获得可检测水平的免疫肽。
2、MHC分子的免疫共沉淀（Immunoprecipitation, IP）
使用特异性抗体（如W6/32用于HLA-I）偶联磁珠或琼脂糖凝胶，进行免疫共沉淀以富集MHC-肽复合物。该步骤的关键在于样本裂解的完整性与抗体的结合效率，直接影响下游肽段的纯度与回收率。
3、弱酸洗脱肽段
使用0.1% TFA等弱酸条件洗脱MHC结合的肽段。洗脱液中含有大量背景物质，因此需要快速、低温操作，防止蛋白降解，并最大限度保留目标肽段。
4、肽段净化与浓缩
洗脱液经C18固相萃取柱纯化，以去除盐分、表面活性剂等干扰物。必要时可进一步进行高pH反相分级，提高低丰度肽段的检测概率。
5、LC-MS/MS分析
采用高分辨率质谱平台（如Orbitrap Exploris、Fusion Lumos等），在无酶切设置下进行全扫描分析。数据采集模式通常为DDA（Data-Dependent Acquisition），也可采用DIA（Data-Independent Acquisition）提高覆盖率。
推荐参数设置包括：
（1）动态排除以避免冗余扫描；
（2）更长的色谱梯度以提升分离度；
（3）更高的AGC与分辨率以增强灵敏度。
6、数据分析与抗原筛选
数据分析需使用支持无酶切搜索的算法（如MaxQuant、PEAKS、Byonic），并设置合适的假发现率（FDR ≤ 1%）。随后将肽段与目标细胞或组织的HLA型信息比对，确认其MHC限制性。结合体细胞突变数据与转录组数据，可筛选出具有免疫原性的新抗原候选。
三、免疫肽组学的应用前景
免疫肽组学作为一种连接细胞蛋白质降解产物与T细胞识别机制的技术，正在多个研究和应用领域展现巨大潜力：
1、个体化肿瘤疫苗设计：通过识别病人特异的新抗原，提高T细胞激活效率；
2、TCR-T或CAR-T靶点发现：确认表达特异性强、免疫原性高的抗原呈递肽；
3、病毒或病原体疫苗开发：例如新冠病毒变异株特异抗原筛选；
4、自身免疫疾病机制研究：识别潜在诱导自身反应的自身抗原肽段。
随着质谱技术、算法能力和多组学整合手段的不断提升，免疫肽组学将在精准免疫治疗领域扮演越来越关键的角色。
免疫肽组学以其高度的生理相关性与技术前瞻性，正在重塑我们对抗原识别与免疫响应的理解。基于LC-MS/MS的肽段直接鉴定方式，已成为新抗原发现和个体化免疫疗法开发的重要支撑平台。未来，随着样本处理效率与算法精度的不断优化，免疫肽组学有望为精准医学带来更多突破。如需定制免疫肽组学研究策略，欢迎联系百泰派克生物科技获取技术咨询与方案支持。
百泰派克生物科技——生物制品表征，多组学生物质谱检测优质服务商
相关服务：
How to order?
