鉴定蛋白质磷酸化和糖基化方法

磷酸化作为蛋白质修饰最常见的形式之一，在细胞内的信号转导通路起着重要的作用，相似的，检测蛋白质糖基化有助于疾病预后和治疗目的的研究，以上两种翻译后修饰类型均对生物研究有着重要意义，鉴定蛋白质磷酸化和糖基化方法如下所述。

鉴定磷酸化的主要方法如下：a.体外磷酸化分析：放射测量激酶反应使用³²P-gamma-ATP，可用于检测体外磷酸化状态；这种方法是半定量，但可以确定磷酸化蛋白的分子量。b.放射性脉冲标记：为了检测体内磷酸化，可以使用放射性脉冲标记；细胞生长于³²P-正磷酸盐存在的条件下，然后用特定抗体免疫沉淀某种蛋白质，沉淀得到的放射性同位素，用SDS-PAGE电泳分析和X射线胶片曝光定量，这种方法可以在各种生理条件下检测磷酸化。c.磷酸化特异性抗体：磷酸化特异性抗体有两种类别。第一类是通用的磷酸化酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸抗体，将结合于任何磷酸化酪氨酸、磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸分子，与邻近的氨基酸残基无关；第二类抗体是磷酸化特定氨基酸表位抗体。当然以上方法均可联合使用数据采集模式或用质谱法识别了（假定的）磷酸化位点之后，利用磷酸化位点的通用抗体，通过免疫沉淀（IP）确定目标蛋白质是否在特定类型的位点被磷酸化。

糖基化分析可以使用以下方法：将待分析蛋白进行酶解消化（如胰蛋白酶消化），之后利用液质联用（LC-MS）或亲水作用色谱-串联质谱（HILIC-MS/MS）分析糖肽，从而鉴定带有特定聚糖分子的所有蛋白质，或者是目标蛋白中聚糖的结合位点。另外，对于某些糖肽，完整蛋白的质谱（MS）分析可以提供蛋白质的种类鉴定及其糖基化状态的数据，但分辨率较低。

综上所述，鉴定蛋白质磷酸化和糖基化的方法虽有不同，但二者都可以利用质谱技术进行分析，包括磷酸化/糖基化蛋白的鉴定、磷酸化/糖基化修饰位点以及修饰水平鉴定。质谱也凭借其优越的分辨率、准确率和灵敏度成为当下最受欢迎的翻译后修饰研究技术之一。

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