体内磷酸化位点鉴定

体内磷酸化的过程就是在激酶的催化作用下，将三磷酸腺苷（ATP）的磷酸根基团转移到蛋白的氨基酸侧链上，ATP随之变为二磷酸腺苷（ADP）。磷酸化修饰可以发生在多种氨基酸残基上，主要集中在肽链中的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基上，这些残基上具有游离的羟基，且本身不带电荷，当磷酸化作用后，蛋白质便具有了电荷，从而使结构发生变化，进一步引起蛋白质活性的变化。

体内磷酸化位点鉴定主要通过质谱法进行检测分析，即通过特定的步骤（如抗体富集、金属富集和凝集素富集等）获得富集的修饰肽段，然后进行串联质谱分析。在一次质谱鉴定中可以可靠地鉴定数千种被修饰的多肽。但是对体内磷酸化位点的定位识别仍然较为武断，对于某些修饰位点的鉴定可能并不可靠。质谱检测所得出的实际质谱图在处理过程中需要考虑的因素更为复杂，如质谱中的噪音信号、磷酸化修饰中未修饰片段的中性丢失以及具有相同质荷比的修饰后的氨基酸与非修饰氨基酸的区别等。

此外，在处理磷酸化蛋白质样品质谱数据时，有必要对修饰位点进行假阳性率（false discovery rate，FDR）的控制。对于肽段磷酸位点鉴定来说，可使用质量可靠性算法评估磷酸化位点可信度，这种算法主要包括基于概率对鉴定质量打分（如建立数据模型）和基于假阳性率（如Target-Decoy算法）进行计算。对于蛋白磷酸化修饰而言，错误定位率（false localization rate，FLR）没有较好的实现方法，通常是通过合成肽段来评估，或者是针对仅包含一个修饰位点的肽段才有较好的效果。目前，可通过位点定位软件试图评估某个给定峰匹配到特定位点的概率，如A-Score算法等；或通过计算两个修饰位点间的搜索引擎给的打分差值进行评估。在选择这些算法的过程中，要综合考虑质谱平台检测的类型、搜库算法与软件的便捷性，从而为后续的分析提供较为可靠的磷酸化位点。

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