怎么鉴定细胞磷酸化修饰

蛋白磷酸化是在酶的催化作用下，将ATP γ位的磷酸基团，转移至蛋白质氨基酸侧链上的过程。蛋白质磷酸化修饰可以参与众多细胞活性调节，包括细胞周期分化以及代谢和神经元通讯等。细胞磷酸化修饰的鉴定主要利用磷酸化激酶活性、质谱或特异性磷酸化抗体等来实现，其大致原理如下所示。

体外磷酸化实验：蛋白激酶通常是多个信号转导网络的常见组分，在ATP的存在下将免疫沉淀的激酶与外源底物共同孵育，之后通过一些报告系统来评估特定激酶对底物的磷酸化，包括显色、放射性或荧光检测。一些特殊的体外磷酸化试验试剂盒能够定量任何可产生ADP的激酶的活性，但评估细胞提取物中的酶活性对于揭示信号通路机制是不够的，且体外活性分析也不能说明内源磷酸酶活性的潜在作用。

磷酸化质谱：可通过质谱技术完成复杂样品中蛋白质磷酸化及其相互作用的全面分析，即磷酸化蛋白质组学，包括磷酸化蛋白和磷酸化肽段的鉴定以及磷酸化残基的测序。蛋白质中磷酸化肽段的富集（如IMAC法）是使用质谱对蛋白质磷酸化进行检测的前提。

磷酸化特异性抗体：磷酸化特异性抗体是利用合成的磷酸化肽段来免疫动物所开发出来的特异性抗体。其原理是通过依赖磷酸化特异性抗体与目的磷酸化蛋白的特异性和亲和力，检测目的蛋白磷酸化位点处的氨基酸残基序列。

当然，除了上述方法，酶联免疫吸附分析（ELISA）、细胞内流式细胞术和ICC/IHC以及磷酸化蛋白多重分析等也可用于磷酸化修饰的鉴定。

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