高灵敏度HCP定量分析策略：标签法与无标签法对比

宿主细胞蛋白（Host Cell Proteins, HCPs）是生物药生产过程中由表达系统（如CHO细胞、大肠杆菌、酵母等）产生的内源性蛋白杂质。即使含量极低，某些HCP仍可能引发免疫反应、影响药物稳定性或降低安全性。因此，准确的HCP定量分析是生物药质量控制的重要环节。高灵敏度检测在工艺开发和优化中同样关键。通过精确测量HCP水平，可以定位纯化过程中去除效率不足的环节，识别难以去除的特定HCP种类，从而优化工艺参数，提高杂质清除率。对长期稳定性研究而言，该方法可提前发现潜在风险，避免储存或运输期间质量下降。总体而言，准确的、高灵敏度HCP定量分析不仅是满足法规要求的必要手段，更是保障生物药物质量、安全性与市场竞争力的核心技术环节。当前，质谱技术凭借高通量、广覆盖的优势，已逐渐成为 ELISA 之外的重要 HCP 分析手段。其中，标签法（Label-based）与无标签法（Label-free）是两大主流定量策略，各有优势与局限。

 

一、HCP质谱定量的核心需求

在HCP定量分析中，定量方法必须同时满足以下几个要求：

1、超高灵敏度：检测低至 ng/mg 级别甚至更低的蛋白含量；

2、高动态范围：覆盖高丰度结构蛋白与极低丰度污染蛋白；

3、良好重现性：确保不同批次、不同生产条件下的数据可比性；

4、可溯源性：定量结果可追溯至具体的蛋白序列与生物学功能。

这对定量策略提出了很高的技术门槛。

 

二、标签法（Label-based Quantification）

1、原理

标签法通过在不同样品中引入稳定同位素标记（如SILAC、TMT、iTRAQ），使同源肽段在质谱中产生可区分的质量偏移，从而实现相对或绝对定量。

常见标签法：

• SILAC（Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture）：在细胞培养阶段引入标记氨基酸，适合代谢标记
• TMT（Tandem Mass Tag）/iTRAQ：化学标记法，可在质谱二级碎裂中释放报告离子，实现多重样品并行分析

 

2、优势

（1）高精度：同位素标记消除了样品制备与上机过程中的批间差异；

（2）多重化：TMT/iTRAQ可一次性分析多达16个样品；

（3）适合绝对定量：结合内标蛋白可获得绝对浓度信息。

 

3、局限

（1）成本较高：标记试剂价格昂贵；

（2）流程复杂：需额外的标记步骤，增加实验时间；

（3）覆盖度可能受限：部分低丰度或难标记肽段可能丢失。

 

三、无标签法（Label-free Quantification, LFQ）

1、原理

无标签法依赖于质谱峰面积（MS1）或谱图计数（Spectral counting）来推算蛋白丰度，不需要引入额外化学或同位素标签。

常见LFQ策略：

• 峰面积积分（Intensity-based LFQ）：直接比较相同肽段在不同样品的峰面积
• 谱图计数（Spectral Count LFQ）：统计肽段被采集到的MS/MS谱次数

 

2、优势

（1）经济高效：无额外标记成本；

（2）操作简化：减少化学修饰步骤，降低样品损失；

（3）广覆盖：适合探索性分析，可发现新的HCP种类。

 

3、局限

（1）批间差异影响大：对样品处理和上机一致性要求极高；

（2）定量精度略低：尤其在低丰度蛋白中；

（3）不适合多批次同时比较：需后期数据归一化与标准化。

 

四、高灵敏度HCP定量分析：策略选择建议



 

随着Orbitrap高分辨质谱、离子淌度质谱（TIMS）、数据独立采集（DIA）等技术的发展，标签法和无标签法的界限正在被打破。未来，HCP定量分析更可能采用混合策略，结合标签法的精度与无标签法的广覆盖，满足生物药企在不同阶段的多样化需求。HCP定量分析不仅是一个检测技术问题，更关乎生物药的质量安全与监管合规。标签法与无标签法各有优劣，合理选择或组合使用，才能在不同应用场景中获得最佳的分析效果。百泰派克生物科技将以先进平台与专业团队，助力生物药企在HCP检测领域取得更高标准的质量控制成果。

 

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