组蛋白翻译后修饰的质谱分析方法全解

在真核细胞中，DNA 并不是孤立存在的，而是缠绕在组蛋白八聚体上形成核小体结构。组蛋白尾部丰富的赖氨酸、精氨酸等可被多种酶催化发生翻译后修饰（Post-Translational Modifications, PTMs），如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等。这些修饰可精细调控染色质构象，从而影响基因转录、DNA修复、复制等关键生物学过程。随着表观遗传学研究的快速发展，组蛋白PTMs分析已成为揭示疾病机制、开发表观药物的前沿方向。质谱（Mass Spectrometry, MS）作为高通量、高灵敏度的分析手段，为系统解析组蛋白修饰提供了强大助力。

 

一、组蛋白翻译后修饰的挑战与技术需求

组蛋白翻译后修饰研究面临的挑战：

1、修饰种类繁多：同一位点可能存在单、双、三甲基化，且可共存

2、修饰位置密集：尤其在H3、H4尾部，多修饰位点相邻甚至重叠

3、丰度差异大：某些修饰极低丰度，难以在复杂背景中检测

4、共修饰复杂性：多位点、多类型修饰共存，需识别其组合状态（combinatorial codes）

 

因此，对质谱平台的灵敏度、分辨率、数据处理能力提出了极高要求。

 

二、组蛋白翻译后修饰的主流质谱策略

1、Bottom-up 方法：切割肽段后分析

（1）步骤概述

提取组蛋白 → 酸性提取富集 → 化学衍生标记（如Propionylation） → 胰蛋白酶或GluC酶切 → LC-MS/MS分析

（2）优点与局限

• 优点：适用于大规模定量、通量高、数据库搜索成熟

• 局限：无法识别远距离修饰的共存状态，可能丢失某些位点信息

 

2、Middle-down 方法：中等长度肽段保留更多修饰信息

（1）步骤概述：

选用AspN、GluC等限制性酶产生10–20 aa左右肽段，保留局部修饰组态

（2）优势与挑战：

• 优势：可获得更完整的局部修饰组合（如H3K9ac-K14ac）

• 挑战：对仪器分辨率和数据解析要求高

 

3、Top-down 方法：直接分析完整组蛋白

（1）特点：无需酶切，直接上样MS/MS，保留全部修饰信息

（2）优势：可解析“组蛋白修饰体”（Histone Proteoforms）

（3）技术难点：质谱解卷积复杂、仪器要求极高，常结合FT-ICR、Orbitrap平台使用

 

三、定量分析策略：从相对到绝对

组蛋白修饰分析不仅需识别修饰种类，还需定量其丰度变化。常用策略包括：

1、SILAC（Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture）

（1）细胞水平标记，适合全局定量

（2）不适用于组织样本或临床材料

 

2、Label-free定量

（1）基于MS信号强度，无需标记

（2）灵活性强，需良好的仪器稳定性和数据归一化策略

 

3、化学标记定量（如TMT/iTRAQ）

（1）通过化学标签实现多样本定量

（2）适用于复杂样本组比较，适配Orbitrap等高分辨平台

 

在百泰派克生物科技，我们基于Orbitrap Exploris 480与FAIMS Pro耦合平台，结合TMTpro 16plex化学标记体系，实现多样本组蛋白修饰定量，CV值<15%，满足高重复性科研需求。

 

四、组蛋白翻译后修饰的样本处理关键步骤

质谱灵敏度不仅取决于仪器性能，前处理流程更是决定性因素：

1、酸提取组蛋白：常用0.2 M H2SO4或HCl提取核组蛋白，保留修饰完整性

2、化学衍生封闭：Propionylation阻断未修饰赖氨酸，提升肽段疏水性、减少酶切位点

3、酶切策略选择：视目标修饰和位点结构决定，需实验优化

4、多级富集策略：可结合抗体富集（如H3K27me3 IP）与质谱富集，提升特异性

 

五、组蛋白翻译后修饰主流工具

1、Mascot、MaxQuant：用于修饰位点识别与定量

2、MSFragger、MetaMorpheus：支持未知修饰的开放搜索

3、EpiProfile、HistoneAnalyzer：专为组蛋白修饰数据设计

4、R包（如ChIPseeker、ComplexHeatmap）：用于可视化富集区域、绘制热图等

 

百泰派克生物科技提供端到端的数据分析服务，涵盖修饰谱构建、功能富集、通路分析与可视化，助力科研人员深入挖掘表观遗传机制。

 

六、组蛋白修饰质谱分析的应用前沿

1、癌症表观遗传图谱绘制：如H3K27me3在EZH2突变癌症中的重塑作用

2、干细胞分化机制研究：动态PTM组合决定细胞命运

3、环境暴露与表观遗传毒理学：评估污染物对染色质修饰的影响

4、表观药物靶点验证：检测抑制剂对特定修饰的调控效果

 

组蛋白翻译后修饰的研究正引领表观遗传学进入精准解析新时代。质谱平台与方法学的进步，为通过LC-MS/MS高效识别组蛋白PTMs提供了技术保障。百泰派克生物科技依托领先的质谱平台、严谨的样本处理流程和专业的数据分析团队，已成功支持数十项组蛋白修饰科研项目，覆盖肿瘤、神经、发育等多个领域。如果您正在进行组蛋白修饰相关课题，欢迎联系我们获取定制化实验方案与技术支持。

 

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