LC-MS/MS技术下的组蛋白修饰分析步骤详解
组蛋白翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）是染色质动态调控的核心机制之一，其种类繁多（如乙酰化、甲基化、磷酸化等），对基因表达、细胞命运和发育进程具有深远影响。近年来，液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）凭借其高通量、高灵敏与高分辨的优势，已成为解析组蛋白修饰谱图的主流手段。与ChIP-seq方法相比，LC-MS/MS无需依赖抗体识别，可同时捕捉多种修饰位点及其共存组合，具备更高的系统性和定量能力。详细解析在LC-MS/MS平台上开展组蛋白修饰分析的全流程，将有效助力研究人员实现更高精度的表观遗传研究。
一、组蛋白修饰分析样本准备：提取高纯度组蛋白
1、组蛋白修饰分析中样本来源与预处理
（1）常用材料包括哺乳动物细胞系（HeLa、ES）、组织样本（肝、脑）、胚胎或类器官
（2）样本预处理应避免使用高浓度盐或去污剂，以防干扰后续色谱分离与质谱检测
2、组蛋白修饰分析中组蛋白富集方法
（1）酸提法：使用0.2 M H2SO4或0.4 N HCl处理核组分，高效释放H2A、H2B、H3、H4
（2）碱性缓冲提取：适用于同时提取组蛋白与非组蛋白核蛋白，但需注意蛋白完整性
3、组蛋白修饰分析中质量检测与定量
（1）使用SDS-PAGE或Coomassie染色确认组蛋白纯度
（2）推荐使用BCA法或NanoDrop测定蛋白浓度，确保后续酶解定量一致性
二、化学衍生与酶解：获得识别性修饰肽段
1、化学衍生保护策略
（1）常规Trypsin酶易在富含Lys/Arg的组蛋白尾部产生短肽
（2）可先对Lys进行化学衍生（如丙酰化、苯甲酰化），屏蔽酶切位点，延长肽段长度
2、多酶联合酶解
（1）GluC、ArgC、AspN等与Trypsin配合可产生覆盖更多修饰位点的肽段
（2）Bottom-up策略适合高通量修饰谱绘制；Middle-down可用于协同修饰组合解析
3、脱盐与上样准备
（1）采用C18小柱或StageTip脱盐，去除缓冲盐和干扰物
（2）肽段溶解于0.1% FA + 2% ACN中，适配nano-LC上样系统
三、LC-MS/MS分析：参数设置与检测优化
1、色谱分离设置
（1）使用纳升液相系统（nanoLC），柱长15–25 cm，粒径≤2 μm
（2）梯度洗脱通常设为90–120 min，提高肽段分辨率和峰容量
2、质谱平台选择与采集模式
（1）推荐使用Orbitrap Exploris、Fusion Lumos或Q Exactive HF等高分辨仪器
（2）采集方式多选用DDA（数据依赖采集）+ PRM（目标定量）联合策略
3、关键参数推荐
（1）MS1分辨率 ≥ 60,000，MS2 ≥ 15,000
（2）碎裂方式采用HCD（高能碰撞），保留修饰特征离子
（3）动态排除时间：20–30 s，优化低丰度修饰信号捕捉
四、组蛋白修饰分析中的数据分析：从原始谱图到修饰谱构建
1、数据库搜索与修饰定位
（1）常用软件：MaxQuant、Byonic、Proteome Discoverer等
（2）设置变量修饰（Variable Modifications）如：Acetyl[K]、Methyl[R]、Phospho[S/T]
（3）质量偏差控制：MS1 ≤ 5 ppm，MS2 ≤ 20 ppm，确保定位精度
2、定量分析策略
（1）Label-free：适合探索性实验，操作简单
（2）TMT/iTRAQ：多样本定量，适用于比较多个处理组或时间点
（3）Peak area 或 reporter ion强度用于相对定量分析
3、修饰模式解读与生物注释
（1）构建修饰热图（heatmap）、主成分分析（PCA）揭示组间差异
（2）结合GO/KEGG富集分析，理解修饰在转录调控、染色质重塑等过程中的作用
（3）与转录组/甲基化组数据联动分析，挖掘多层次调控机制
五、LC-MS/MS技术下的组蛋白修饰分析的常见挑战与解决方案
1、LC-MS/MS中低丰度修饰检测难
（1）采用多酶切策略提高修饰覆盖率
（2）结合PRM靶向检测增强低丰度位点的信噪比
2、LC-MS/MS中同位点多修饰互相干扰
（1）Middle-/Top-down策略可解析多重修饰共存模式
（2）高分辨率谱图联合人工审阅验证关键位点
3、LC-MS/MS中数据冗余与假阳性多
（1）严格设置FDR < 1%，并通过手动质谱图验证高置信肽段
（2）使用多引擎联合分析（如MaxQuant + Byonic），提升识别准确性
LC-MS/MS技术正以前所未有的分辨力揭示组蛋白修饰的时空动态。通过系统性的修饰谱分析，科研人员可在发育生物学、干细胞研究、疾病表观调控等前沿领域挖掘出更深层次的生物学规律。百泰派克生物科技将继续依托专业的质谱平台与经验丰富的技术团队，助力您的组蛋白修饰研究快速推进，从原始数据到生物发现，走得更稳、更远。
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