如何在不降低产量的情况下提高外泌体纯度？

外泌体（Exosomes）作为细胞间信息传递的重要媒介，近年来在肿瘤生物学、神经退行性疾病、液体活检及药物递送等领域展现出巨大潜力。然而，外泌体的生物功能极易受到杂质干扰，如游离蛋白、脂质体、细胞碎片等非特异性成分，这对下游组学分析、功能验证乃至临床应用构成严峻挑战。常规分离方法在追求高外泌体纯度的同时，往往面临产量下降的瓶颈。因此，如何在不显著降低产量的前提下提高外泌体纯度，成为科研人员和生物技术企业亟需解决的核心问题。

一、外泌体纯度为何如此关键？

外泌体是一类直径为30–150 nm的细胞外囊泡，因其在细胞间通讯、疾病标志物发现及药物递送等领域具有重要价值，已成为转化医学和生物技术的研究热点。然而，高外泌体纯度的获取仍然是一项挑战。常规纯化方法往往存在以下问题：

• 产物混杂：共沉淀的蛋白质、脂质体、非外泌体小囊泡影响下游分析
• 回收率低：高纯策略（如密度梯度超离）常以牺牲产量为代价
• 批次间差异大：导致数据可重复性差，影响临床前研究

因此，在不显著降低产量的前提下提升外泌体纯度，已成为外泌体分离领域的技术突破口。

二、外泌体纯度的评估标准

在提升外泌体纯度前，我们首先需要明确：如何定义“纯”？

1、常见定量指标

粒子数/蛋白量（Particle-to-Protein Ratio）：高比值往往意味着较少污染蛋白。

Western Blot 或 Mass Spectrometry 检测特异性标志物：

• 阳性：CD63, CD81, TSG101 等
• 阴性：Calnexin, Albumin 等非外泌体蛋白

2、形态学分析

透射电镜（TEM）或纳米粒子追踪分析（NTA）可判断颗粒大小分布及聚集程度。

外泌体纯度的提升需同时考虑成分特异性和杂质去除率，而非仅靠产量或颗粒数判断。

三、提纯策略：如何在外泌体纯度与产量之间寻求平衡？

1、优化上游：从源头减少杂质干扰

（1）选择合适的培养基

• 使用无外源蛋白的培养体系（如 Exosome-depleted FBS），避免牛源外泌体混入
• 控制细胞密度与培养时间，避免因凋亡或细胞碎片增加背景杂质

（2）上清液预处理

• 低速离心（300–2,000g）去除细胞和大颗粒
• 过滤（0.22 μm）去除细胞碎片，有助于后续高效纯化

2、技术升级：外泌体纯度分离策略

（1）差速超速离心 + 膜过滤优化组合

• 经典方法，适合大体积样本（>100 mL）
• 弱点在于纯度有限、操作复杂，但结合0.1 μm 过滤 + 洗涤步骤可有效提升纯度

（2）密度梯度超离心（Density Gradient UC）

• 利用蔗糖或碘克沙醇梯度，分离密度不同的囊泡
• 优点：高纯度，缺点：费时，适用于分析级别提纯

（3）尺寸排阻色谱（SEC）

• 基于粒径分离，能显著去除游离蛋白
• 易于标准化、自动化，适合中高通量研究
• 可与UC或TFF联用以提升效率

（4）TFF（Tangential Flow Filtration，切向流超滤）

• 保留颗粒同时洗去小分子污染物
• 优于常规离心浓缩，不易造成外泌体破裂
• 适合大规模制备

（5）免疫亲和纯化

• 通过抗体靶向CD63/CD81等表面标志物选择性提取
• 高纯度，适合特定亚群研究，但成本较高、产量有限

3、避免常见操作误区

• 盲目追求粒子数：非外泌体颗粒（如脂质体、细胞碎片）也能被NTA检测；
• 过度离心：高转速长时间会引起外泌体变形甚至破裂；
• 无效洗涤：去除非特异性蛋白是关键，尤其是培养基来源污染；
• 样本批次差异大：严格控制起始条件和操作一致性是提升纯度和可重复性的保障。

外泌体纯度制备不仅关系到实验数据的可靠性，更直接影响其在诊断标志物筛选、功能验证及临床转化中的应用前景。在实际操作中，纯度与产量并非零和博弈，通过科学设计流程、合理组合分离技术，可以实现二者之间的动态平衡。百泰派克生物科技基于多年组学平台积累，构建了兼顾效率与可重复性的外泌体纯化体系，助力科研人员在复杂生物样本中获得高质量外泌体，并无缝对接蛋白组、代谢组等多组学分析。

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