如何分析蛋白的二硫键？

一、为什么要分析二硫键？

二硫键不仅维持蛋白质三级结构的稳定性，还影响其生物活性与构象完整性。错误的二硫键配对可能导致：

（1）功能丧失（如失活的抗体）

（2）聚集或不溶性蛋白

（3）免疫原性风险增加（药物开发中常见）

因此，精准识别二硫键的连接方式和位置，是蛋白结构功能研究的关键步骤。

 

二、如何分析蛋白的二硫键？

1、还原/非还原质谱对比法

（1）原理：

通过对同一样本在还原（如DTT、TCEP处理）与非还原状态下进行蛋白酶消化和质谱分析，比较肽段的差异，推测二硫键连接关系。

（2）实验流程：

• 分别准备还原和非还原样本
• 酶解（如胰蛋白酶）
• LC-MS/MS 检测
• 分析差异肽段：非还原样本中出现跨肽段连接的峰即为潜在二硫键

（3）优势：

• 操作简便，适用于大多数蛋白
• 可识别二硫键连接的肽段

（4）局限：

• 无法精确定位连接的Cys残基
• 对复杂蛋白（如多二硫键抗体）解析能力有限

 

2、ETD/ECD 质谱技术

（1）原理：

ETD（Electron Transfer Dissociation）和ECD（Electron Capture Dissociation）可在保留二硫键的同时对多肽主链进行断裂，从而实现二硫键原位保留、Cys定位。

（2）实验流程：

• 非还原条件下进行蛋白酶解
• 使用ETD或ECD进行MS/MS碎裂
• 精确识别跨肽段及Cys残基位置

（3）优势：

• 原位保留二硫键结构
• 可准确定位Cys-Cys配对
• 对于结构复杂蛋白（如IgG）效果更好

（4）局限：

• 仪器依赖高端质谱（如Orbitrap Fusion、Exploris系列）
• 数据分析相对复杂

 

3、Top-down 质谱法

（1）原理：

直接对完整蛋白进行MS/MS碎裂，无需酶解，保留所有天然构象信息，包括二硫键。

（2）优势：

• 保留蛋白原始构象
• 适用于蛋白药物完整性验证

（3）局限：

• 仅适用于低分子量蛋白（<50 kDa）
• 对仪器要求极高，灵敏度受限

 

4、定点突变验证（Cys→Ser）

通过点突变手段去除特定Cys残基，结合功能检测与质谱分析，验证其是否参与关键二硫键。

优点：可验证功能影响

缺点：实验周期长，非高通量方法

 

三、百泰派克生物科技蛋白二硫键分析优势

百泰派克生物科技为研究者提供高分辨率、高灵敏度的蛋白二硫键分析解决方案，支持从构象研究到药物质控的全流程需求。

1、技术平台支持

（1）Orbitrap Exploris 480 / Fusion Lumos

（2）ETD碎裂功能全面支持

（3）高覆盖率蛋白酶解策略（Trypsin、Lys-C、Glu-C等组合）

 

2、服务亮点

（1）可实现抗体重链-轻链连接位点识别

（2）支持天然蛋白与重组蛋白的二硫键图谱构建

（3）专属技术顾问协助设计实验策略

 

 四、应用场景举例

 



 

精准解析蛋白质中的二硫键，不仅有助于揭示其结构与功能关系，更在药物研发和生物合成领域具有重要应用价值。通过现代质谱平台与专业技术团队的协作，科研人员可以更清晰地绘制出蛋白构象的“地图”。若您正开展蛋白质结构、功能或药物相关研究，欢迎联系百泰派克生物科技获取专业的二硫键分析服务。

 

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相关服务：

蛋白二硫键鉴定和定量分析