测定磷酸化的位点

蛋白质磷酸化是一个通过蛋白激酶催化将ATP的磷酸基团转移到底物的氨基酸残基（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）上或者在信号作用下结合GTP的过程，其在细胞信号转到过程中起重要作用，是生物体内一种较为普遍的调节方式。

磷酸化是研究较为普遍和深入的翻译后修饰，且参与多种细胞生命活动。磷酸化位点是指发生磷酸化修饰的氨基酸在蛋白质中所处的位置，可通过质谱技术（LC-MS/MS）进行测定，包括验证已知磷酸化位点或发现新磷酸化修饰位点，最终了解蛋白磷酸化相关的分子机制。

质谱是鉴定激酶体外特异性磷酸化氨基酸位点的主要方法，该方法包括以下步骤: ①蛋白的溶液酶切，令待测磷酸化位点的底物蛋白或肽段进行体外激酶反应。②离子亲和层析IMAC法富集磷酸化肽段，对样品磷酸化肽段预先分离纯化并进行富集以降低样品复杂程度，从而改善磷酸肽的质谱信号并提高质谱检测深度。③质谱分析，将富集得到的磷酸化肽段冰浴后进行LC-MS/MS质谱检测与纯化分析。由于磷酸化肽段离子在质谱中容易丢失磷酸形成特征性的中性丢失碎片离子，进而可以利用多级质谱对碎片离子进行质谱分析。结合假阳性率评估，利用得到的质谱图与其对应的二级谱数据库搜索结果进行匹配，通过门槛值的设定可实现特定可信度下的蛋白磷酸化位点的鉴定。

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