单克隆抗体De Novo测序的完整流程
一、为什么要对单克隆抗体进行De Novo测序？
在抗体药开发与研究中，获取全长抗体氨基酸序列是基础起点。然而，在以下情境中，常规的基因测序路径难以奏效：1、抗体仅有纯化蛋白，无法获得B细胞或mRNA；2、抗体来自外部渠道、文献报道或商业来源，缺乏原始序列信息；3、早期研发阶段或体内筛选出的克隆，需结构回溯验证；4、专利保护或一致性验证中，需要“看得见”的分子结构。此时，基于质谱的单克隆抗体De Novo测序成为科学的解决方案。该技术能够在没有参考序列的前提下，重建出抗体的轻链（LC）与重链（HC）全长序列，覆盖CDR区域，并辅助后续的重组表达与功能验证。
二、单克隆抗体De Novo测序的标准流程概览
1、抗体样本准备与质量评估
首先需要获得高纯度的抗体蛋白样本。建议提供≥20 µg的抗体溶液或清晰SDS-PAGE条带。如原样本为上清、血清等复杂背景，建议进行Protein A/G纯化或PAGE切胶纯化。百泰派克提供完整的上游处理服务，确保进入质谱分析前的样本质量稳定、背景低、杂蛋白干扰少。
2、多酶酶解策略设计
酶解是影响抗体序列覆盖度的关键因素。传统单一酶（如Trypsin）可能无法有效切割CDR区或疏水区，导致覆盖盲区。因此，项目将采用3~5种不同专一性的蛋白酶（如Trypsin、Chymotrypsin、AspN、LysC、GluC）进行并行消化。多酶联用能生成高重叠率、多角度切割的肽段集合，为后续拼接提供坚实基础。
3、LC-MS/MS高分辨率质谱采集
将不同酶解体系的肽段样品分批进行纳流液相色谱分离（NanoLC），并使用高分辨率质谱平台（如Orbitrap Fusion Lumos、timsTOF Pro等）进行串联质谱采集。通过HCD、CID、ETD等多种碎裂模式，获取肽段在MS/MS层面的b/y离子信息，为De Novo算法提供基础原始数据。
4、De Novo算法分析与序列拼接
采集到的MS/MS碎片图谱将被送入多个主流De Novo软件（如PEAKS Studio、Novor、pNovo等）进行肽段序列预测。随后结合人工审阅、结构模板对照及片段重叠关系，对抗体的轻链和重链进行全长序列拼接重建。CDR区、FR区、hinge区等关键功能域会被分别标注，特殊氨基酸如I/L（等质量异构体）也将人工确认。
5、翻译后修饰识别与注释（可选）
抗体蛋白常伴随糖基化、氧化、脱酰胺等翻译后修饰（PTMs），这些信息对表达系统选择、功能活性分析等有重要意义。项目可同时进行修饰识别模块分析，并在交付结果中提供修饰位点、修饰类型与可信度评分。
6、序列验证与表达模板构建（可选）
完成序列解析后，若客户有表达需求，百泰派克生物科技可进一步提供：
（1）cDNA序列反向翻译
（2）表达载体构建与合成
（3）CHO/293细胞瞬转表达验证
（4）ELISA、Western Blot等活性检测
从蛋白序列到功能抗体，一站式完成结构重建与功能复现，真正让测序结果可验证、可重组、可转化。
三、百泰派克在单克隆抗体De Novo测序中的优势
百泰派克生物科技将抗体De Novo测序标准化为一套严谨、高覆盖、高还原度的服务体系。我们的技术优势包括：
1、多酶协同体系优化：覆盖率可达95%以上，CDR全区段识别率＞98%
2、双平台并行质谱分析：Orbitrap × timsTOF组合，提高数据通量与准确性
3、自研算法+人工复核机制：提升拼接准确率，杜绝轻链/重链错配
4、修饰图谱同步解读：不仅得序列，更得修饰与结构功能信息
5、可选表达验证服务：从蛋白到功能的真实闭环，结果可靠可复现
我们已成功为抗体药企、科研院所、医院课题组等多个客户完成抗体重建、老抗体复现、抗原亲和抗体筛选、功能验证等项目，帮助其加快抗体工程进度或解决专利保护难题。单克隆抗体的结构解析，不应止步于序列获取，而应延伸到功能复现、工程设计和产业转化。De Novo测序作为连接实验样本与表达系统之间的桥梁，是目前唯一可实现“从蛋白直接还原全结构”的方法学。
百泰派克生物科技将持续通过高精度质谱平台、优化的实验流程和专家级数据分析，为您提供可信、高质量的抗体De Novo测序服务，助力您的抗体开发更加高效、透明、可控。如您有抗体样本待解析，欢迎提交样本信息，获取专属评估与技术解决方案。
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