蛋白质组学质谱分析实验成功的小技巧
- P值：代表肽段鉴定为“假阳性”的可能性，即实际并非该肽段却被错误地鉴定出来的概率
- Q值：对P值的进一步调整，它考虑了FDR（错误发现率），即尽管信号显示为显著但实际上并不显著的概率
- 得分（在Mascot软件中）：代表肽段鉴定为随机事件的可能性，即鉴定结果并非基于真实肽段特征而是由于随机因素导致的概率
质谱分析是基础和高级药物研发中常用的分析方法，它可以识别简单混合物中的化合物，也可以分析更复杂的样品组（如蛋白质组学），应用范围十分广泛。
蛋白质组和蛋白质组学
蛋白质组涵盖了生物体内所有的蛋白质，而蛋白质组学则是对蛋白质组在环境影响、内在变化（如细胞分化或死亡）、细胞类型、细胞区室或细胞周期等条件下的动态变化进行研究。
质谱技术为蛋白质组学研究提供了有力工具，它能揭示蛋白质在丰度、异构体及修饰（如泛素化、类泛素化、磷酸化）等方面的变化。传统研究特定蛋白质之间相互作用的方法往往是通过系统突变和杂交的方式，这些方法可能引入非自然的突变或杂交产物，影响结果的准确性和可靠性，同时实验过程复杂且耗时。利用质谱法研究蛋白质互作很好的解决了这些问题，且灵敏度和准确性都得到了大大的提升。
质谱法以其独特的优势，为解答众多生物学问题开辟了新的途径。然而，由于其高灵敏度和技术复杂性，要求我们在进行样本制备和数据分析时，必须格外细心严谨。
在开始质谱实验之前，我们需要注意的问题有以下几点：
问题1：我的实验要解决什么生物学问题，质谱可以帮助回答它的可能性有多大？
问题2：我使用的是什么类型的样品？
问题3：我感兴趣的蛋白质的丰度如何，检测的难易程度如何？
问题4：蛋白质修饰的稳定性如何，如何避免蛋白质降解？
问题5：如何避免干扰检测的样品污染（例如角蛋白、聚合物）？
问题6：实验中需要包括哪些对照？
问题7：我应该选择哪种酶和酶解类型来获得完美大小的肽片段进行检测？
问题8：我应该使用什么类型的软件进行分析？
质谱数据分析的4个基本参数
强度:
强度直接反映了单个肽段的丰度，即其被质谱仪检测到的次数。该值不仅取决于原始蛋白的浓度，还受肽段太小及其“飞行”能力的影响。值得注意的是，并非所有肽都能在质谱仪中“飞行”，如果肽无法被有效电离或离子过于不稳定发生碎裂，它们可能无法被质谱仪准确检测到。
肽段数量:
这里的肽段数量指从同一蛋白质中检测到的不同肽段的总数。如果肽段数量较低，可能意味着蛋白质本身的丰度较低，或者肽段的大小不适合当前的检测条件（太小或太大）。在这种情况下，我们可以考虑调整肽段的消化时间，或者尝试使用不同的酶来进行处理，以优化肽段的检测效果。
覆盖强度：
覆盖率与肽段数量直接相关，是指被检测肽段覆盖的蛋白质比例。在较简单的样本中，良好的覆盖率水平应在40%至80%之间（主要是处理纯化蛋白质时），这主要取决于酶识别位点的数量以及消化后的肽段长度。而在更复杂的蛋白质组样本中，蛋白质的覆盖率范围通常在1%至10%之间。
P值/Q值/得分:
肽段鉴定结果需要通过统计学显著性分析进行验证，具体方法依赖于所使用的软件工具。通常情况下，这种验证会通过P值、Q值或得分来体现，并且这些指标应当小于0.05以确保结果的可靠性。
通过综合考量这些指标，我们能够更加准确地验证肽段鉴定的可靠性。
5个重点提示
提示1：
实验开始前，需要检查目标蛋白质的丰度、调控机制以及表达谱。对于蛋白质组数据集，还需特别关注细胞周期的调控情况以及细胞系的特性。例如，癌细胞系通常存在转录调控或信号通路中断的现象，导致它们不受控制的生长。
提示2：
在进行实验时，建议使用带有滤嘴的吸头、一次性移液管以及高效液相色谱（HPLC）级水。同时需要对塑料和溶液进行高压灭菌处理，在清洁玻璃器皿时避免使用洗涤剂，以免引入不必要的杂质。
提示3：
检查所有缓冲液组分的兼容性，包括蛋白酶抑制剂、去污剂、乙二胺四乙酸（EDTA）和还原剂。此外，还需要仔细核查缓冲液的盐浓度和pH值，以确保它们符合实验要求。
提示4：
为确保蛋白质样品的稳定性，应将蛋白质样品保存在低温环境下。日常工作时置于4°C 环境下，避免反复冻融；长期储存置于-20°C至-80°条件下）
提示5：
为确保实验结果的准确性，在每一步实验完成后都应对其进行验证。常用的验证方法有蛋白质印迹法（Western blot）和考马斯亮蓝染色法。
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