蛋白质C端测序：方法、挑战与优化

蛋白质是生命活动的核心执行者，其结构与功能息息相关。科学家们长期关注蛋白质的N端测序，而对蛋白质的C端（羧基端）研究相对滞后。实际上，C端在调控蛋白质稳定性、亚细胞定位、信号传导乃至降解中都发挥作用。尤其在蛋白质翻译后修饰、非典型剪切事件及疾病标志物挖掘方面，C端信息正展现出独特价值。

 

那么，如何精确测定蛋白质C端？当前的技术有哪些难点，又该如何突破？本文将为你全面梳理。

 

一、方法

蛋白质C端测序的关键在于准确识别并富集C端肽段，目前主流策略主要包括三大类：酶切法、化学标记法和质谱直接鉴定法。

1、酶切法

通过使用羧肽酶（Carboxypeptidase）逐步从蛋白质C端剪切氨基酸残基，结合质谱监测释放的氨基酸序列，可推断原始序列。
此法优点是操作直接，适用于较短序列，但对蛋白构象和修饰敏感，效率易受限。

 

2、化学标记与富集法

为了在复杂样本中准确识别C端肽段，常通过化学标记增强其特异性。常用策略包括：

（1）TMPP-AcOSu标记：将TMPP（Trimethylammoniumbutyryl）化学试剂选择性修饰C端，提高质谱信号强度；

（2）固相富集法：将肽段C端与固相介质偶联，未结合部分洗脱，保留C端肽段；

（3）异源交联剂辅助捕获：通过特定交联剂（如Biotin-NHS）连接C端与亲和载体，进行拉下纯化。

 

这些策略提升了C端信号的检测灵敏度，适用于复杂背景下的低丰度C端肽段识别。

 

3、质谱直接测序法

基于高分辨质谱（如Orbitrap、FTICR或TOF）对完整蛋白或酶切肽段进行MS/MS碎裂，通过解析碎片离子信息，重建C端序列。该方法常结合数据库比对或de novo算法进行C端肽段推断，适用于未知蛋白或不依赖已有注释的样本。

 

此外，配合特异性酶（如LysargiNase、GluC等）设计“半特异性酶切”策略，也可有效提高C端肽段的覆盖率。

 

二、挑战

尽管上述技术不断发展，但C端测序仍存在一些关键性难点：

1、C端肽段产生效率低：传统酶切法多偏向产生N端肽，C端残留肽比例较少；

2、缺乏C端特异性酶：目前广泛使用的胰蛋白酶等酶对C端识别能力有限；

3、C端修饰复杂多变：如酰化、异构化、环化等结构修饰干扰碎裂模式；

4、生物样本背景复杂：易被高丰度非目标肽段干扰，导致C端信号被“掩盖”；

5、数据分析工具不足：现有生信工具多优化于N端测序，C端识别效率偏低。

 

三、优化策略

为了克服上述挑战，研究人员已经提出了一些优化策略，以提高蛋白质C端测序的准确性和效率：

1、多酶协同酶切：结合Trypsin、GluC、AspN等不同切点的酶提高C端肽段比例；

2、引入C端富集流程：如固相提取、亲和捕获或同位素标记策略；

3、使用高分辨质谱平台：如Thermo Orbitrap Fusion Lumos系统，大幅提升检测灵敏度；

4、整合AI辅助数据分析：通过机器学习识别C端特征碎片，提高识别准确性；

5、优化前处理流程：采用温和处理条件减少C端修饰或剪切过程中的损失。

 

蛋白质C端测序技术在揭示蛋白质结构与功能、研究翻译后修饰以及生物制药等方面具有意义。随着新方法的不断优化和技术的发展，其准确性和应用范围将得到显著提升。百泰派克生物科技提供准确且快速的蛋白质N/C端测序服务，获国家CNAS实验室认可，助力研究人员全面理解相关内容。

 

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