C端测序：避免LC-MS/MS分析中的8大常见错误

蛋白质组学中的LC-MS/MS分析（液相色谱-串联质谱）广泛应用于蛋白质鉴定、修饰研究和定量分析。然而，在C端测序（C-terminal sequencing）过程中，许多研究人员可能会在实验设计、数据采集和数据分析等方面犯下一些常见错误，影响最终的研究质量和结论的可靠性。本文将总结LC-MS/MS分析中C端测序的八大常见错误，并探讨如何避免这些问题，以获得更准确的蛋白质组学数据。

 

一、样本处理阶段的常见误区

❌ 错误1：样本制备不充分

在C端测序中，样本纯度对后续酶解和质谱分析影响尤为显著。高盐、去污剂、宿主蛋白等杂质会干扰离子化效率、降低信噪比。

✅ 建议：

• 采用超滤、凝胶过滤等方式去除杂质；

• 控制蛋白浓度；

• 样本-80℃保存，避免反复冻融，防止蛋白降解或C端修饰丢失。

 

二、酶解策略中的技术盲区

❌ 错误2：仅依赖胰蛋白酶进行酶解

胰蛋白酶对C端肽段识别有限，容易错过重要信息。

✅ 建议：

• 联合使用 Glu-C、Asp-N、Lys-C 等不同特异性酶；

• 尝试蛋白酶K等非特异性酶提高覆盖；

• 优化酶解时间、pH、温度和E:S比，避免过度或不完全酶解。

 

三、质谱设置中的“隐性失误”

❌ 错误3：质谱仪参数未优化

碎裂模式、质量分辨率、碰撞能量（NCE）若未根据样本类型进行调整，极易造成C端信号丢失。

✅ 建议：

• 对翻译后修饰蛋白优先选择 ETD 或 EThcD 模式；

• HCD 可增强 y 离子，有利于C端序列判断；

• 合理设置质量窗口和NCE，建议通过预实验调优。

 

四、液相分离的不当设置

❌ 错误4：色谱保留时间不合理

C端肽段的理化特性与普通肽段可能不同，若分离不充分或过早洗脱，容易信号弱、重叠多。

✅ 建议：

• 使用 UHPLC 提升分辨率；

• 优化流动相有机比例和pH值；

• 选择适合的色谱柱（如C18、C8）匹配C端疏水/亲水特性。

 

五、数据分析流程中的配置问题

❌ 错误5：数据库搜索参数设置不当

使用默认参数，往往会忽视C端非特异性酶解和常见修饰，错失关键序列。

✅ 建议：

• 设置“允许非特异性酶切”；

• 添加如C端乙酰化、酰胺化、磷酸化等可变修饰；

• 控制 FDR ≤ 1%，确保识别可信度。

 

六、结果筛选标准不科学

❌ 错误6：过滤策略过松或过严

过严的过滤（如FDR过低）可能过滤掉真实肽段，过松则增加假阳性。

✅ 建议：

• 综合考虑匹配分数、肽段覆盖率、修饰位置等参数；

• 使用多指标评分策略提升筛选精度。

 

七、C端修饰被忽视

❌ 错误7：未考虑C端翻译后修饰

酰化、泛素化、糖基化等C端修饰可能显著改变碎裂行为，导致分析失败。

✅ 建议：

• 根据目标蛋白特点，在数据库设置中加入相应修饰；

• 必要时结合 PRM 靶向验证补充确认。

 

八、验证手段缺失

❌ 错误8：结果未多重验证

仅凭一次测序结果作结论，可能导致误判。

✅ 建议：

• 采用不同酶解策略重复验证；

• 合成肽段验证；

• 融合突变体验证关键C端序列。

 

C端测序LC-MS/MS分析技术的精准实施，需要研究者深刻理解其与常规蛋白质组学分析的范式差异。从样品制备到数据分析的全流程优化，本质上是对蛋白质羧基化学特性的深度适配。百泰派克生物科技提供专业的蛋白质N/C端测序服务，可解决您的项目问题，加速您的研究项目，为您带来优质的服务体验。

 

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