对多对二硫键位置如何进行鉴定
二硫键是蛋白质肽链内或肽链间两个半胱氨酸残基上巯基的硫原子共价结合形成的,是一种常见的蛋白质翻译后修饰方式。二硫键对蛋白质的正确折叠、定位、稳定性以及生物学功能具有重要意义,在一些蛋白质类药物特别是抗体药物中,二硫键更是决定其质量的关键属性。不同的蛋白质中二硫键的数目和所处的位置都是不同的,有些蛋白质没有二硫键结构,有些蛋白有且不止有一个二硫键结构,这些差异有助于形成蛋白质多样性。
目前,常见的二硫键鉴定技术主要包括核磁共振法、X射线晶体法、对角纸电泳法以及液相色谱串联质谱法等,基于质谱的鉴定技术已经成为表征二硫键的主要分析工具。利用液相色谱串联质谱法分析蛋白单个二硫键或多对二硫键在原理上没有不同,都包括蛋白酶切、肽段分离、质谱检测、数据比较分析等步骤,大致流程为将蛋白质进行酶切并利用色谱技术对肽段进行分离和收集,再通过串联质谱检测获得肽段的分子量以及肽段的氨基酸序列,最后比较还原性与非还原性蛋白的肽段分子量和氨基酸序列,找出差异片段,以确定二硫键的位置。
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