Bottom-Up蛋白质组学数据分析流程
Bottom-Up蛋白质组学通过酶解蛋白质获得肽段，再经质谱鉴定与定量，最终反推蛋白质的种类与丰度。这一方法以其高通量、灵敏度高和适配性强等优点，广泛应用于生物标志物发现、疾病机制研究和药物开发等领域。以下是标准的Bottom-Up蛋白质组学数据分析流程。
一、样本准备与蛋白质酶解
Bottom-Up蛋白质组学的第一步是蛋白质提取和酶解。针对不同的样本类型，如组织、细胞或体液，需选用合适的裂解方法和缓冲液，确保蛋白质提取完整并保留天然修饰信息。随后通过BCA或Bradford法对蛋白浓度进行定量，并利用SDS-PAGE初步评估蛋白质量。核心步骤是使用胰蛋白酶对蛋白质进行特异性酶解，形成适合质谱分析的肽段混合物，必要时还可使用Lys-C、Glu-C等酶进行联合酶解以提高覆盖率。
1、蛋白质提取
不同组织或细胞类型需采用特定的裂解液与处理方法（如超声、加热或机械破碎），以确保蛋白质完整性和提取效率。
2、蛋白质定量与质量控制
采用BCA或Bradford法进行蛋白浓度测定，结合SDS-PAGE初步评估蛋白质质量。
3、酶解处理（通常使用胰蛋白酶）
通过酶切将蛋白质分解为肽段，形成适于质谱分析的复杂肽混合物。
二、LC-MS/MS分析
酶解后的肽段先经过高效液相色谱分离，再进入质谱仪进行MS1和MS2扫描。当前主流质谱平台如Thermo的Orbitrap Exploris、Bruker的timsTOF Pro，以及Sciex的TripleTOF均具备高分辨率和高扫描速度，适用于不同的研究需求。常用的质谱采集模式包括：
DDA（Data-Dependent Acquisition）：选择信号强度前N的前体离子进行碎裂分析。
DIA（Data-Independent Acquisition）：无偏采集所有离子窗口，适合大规模蛋白定量。
百泰派克生物科技依托Orbitrap Exploris与timsTOF等高端平台，配合高精度纳升液相系统，实现高覆盖、高重复性的数据采集，满足复杂样本的深度分析需求。
三、原始数据处理
1、数据格式转换
不同厂商的质谱仪生成的数据格式各异，如.raw（Thermo）、.wiff（Sciex），需转换为标准格式（如.mzML、.mgf），以便于在开源或商业软件中进一步
2、肽段鉴定
数据转换后，需借助数据库搜索引擎（如MaxQuant、MSFragger、Proteome Discoverer）将MS/MS谱图与参考蛋白数据库进行比对，从而识别肽段序列及其修饰信息。FDR（通常控制在1%）用于保障鉴定的置信度。
3、蛋白质推断与定量
通过将多个来源于同一蛋白的肽段进行整合，可推断蛋白的存在与丰度。定量策略包括：
（1）Label-free：无需标记，适用于大样本队列；
（2）TMT/iTRAQ等同位素标记法：可实现多样本批量比对；
（3）DIA：结合光谱库实现更高的定量稳定性和深度。
四、数据质量控制与标准化
为确保数据分析的准确性与可靠性，必须对原始数据进行多维质量控制：
（1）缺失值处理：采用填补（如KNN、随机森林）或过滤策略；
（2）样本间一致性检验：计算皮尔逊相关系数，排查异常样本；
（3）PCA分析：判断样本是否存在批次效应或分类趋势。
五、差异表达分析
在完成数据标准化后，可开展差异表达分析。通过t检验、ANOVA或基于线性模型的limma方法，筛选出在不同条件下显著变化的蛋白。常用阈值设定为|log2FC| > 1 且p < 0.05。可视化方式包括火山图、热图、箱线图等，揭示表达模式和分组特异性。
六、功能富集与通路分析
识别出的差异蛋白需进一步进行生物学解释。可借助GO、KEGG、Reactome等数据库，开展功能注释与通路富集分析，揭示其参与的生物过程、分子功能或信号通路。同时，利用STRING数据库构建蛋白互作网络（PPI），识别关键调控节点（Hub Proteins），并通过Cytoscape进行网络可视化与模块分析。
Bottom-Up蛋白质组学数据分析流程覆盖从样本到生物学解读的全链路。每一环节的优化都将直接影响数据的深度与可信度。借助百泰派克生物科技在样本处理、质谱平台和生信分析方面的综合优势，研究人员可以专注于科学问题本身，而非数据处理细节。如您有蛋白质组学项目需求，欢迎咨询我们定制高通量、高准确率的质谱解决方案！
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