蛋白质N端的重要生物学功能和测序技术

    蛋白质和多肽N端的重要生物学功能

    蛋白质的合成从N端开始,蛋白质N端的序列组成影响蛋白质的整体生物学功能。例如,N端序列影响蛋白质的半衰期,并与蛋白质亚细胞器的定位有关。蛋白质的N端测序分析有助于分析蛋白质的高级结构并揭示蛋白质的生物学功能。随着现代生物制药工业的发展,出现了许多蛋白质和肽类药物分子。这些蛋白质药物分子的N端序列的分析和确认也是制药行业质量控制中的重要环节。N端区域也是蛋白质和肽的重要结构和功能位点,大多数蛋白质可以通过N端的几个氨基酸残基来鉴定。例如,鉴定蛋白质和肽类药物N端的人工修饰位点,如环化修饰和甲基化修饰,可以为提高其降解稳定性和延长功效奠定基础。

    蛋白质和多肽的N端测序技术

    Edman降解
    埃德曼降解法是一种非常成熟和经典的蛋白质和多肽N端测序的方法,被广泛应用于生物技术领域。Edman降解测序的原理主要是指通过循环反应从蛋白质的N端一一鉴定氨基酸类型,从而确定蛋白质的N端序列。在碱性条件下,异硫氰酸苯酯(PITC)与待分析肽的N端氨基反应,形成苯胺硫代甲酰胺衍生物,然后用酸处理耦合产物。肽链的N端被选择性切割,释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。提取的氨基酸衍生物在强酸性条件下转化为稳定的PTH-氨基酸,降解的PTH-氨基酸可以通过HPLC或电泳分析来得到蛋白质或肽的N端序列信息。

    Edman降解测序的缺点

    Edman降解法受到许多限制,例如用于序列分析的蛋白质或肽必须具有高纯度,不适合用于高通量分析,灵敏度不够等。

    质谱N端测序
    基于质谱的蛋白质N端序列分析技术,尤其是电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)技术的应用,质谱在蛋白质结构分析中的应用发生了一次革命性的飞跃。高灵敏度、高精度、高分辨率和高通量生物质谱技术为蛋白质N端测序提供了一个重要的选择,基于质谱的N端测序技术可以实现N端封闭和PEG化蛋白质的序列测定,这是对Edman测序的有效补充。该分析可用于确认和鉴定重组蛋白药物的高级结构完整性以及重组蛋白N端序列的修饰位点。

    质谱鉴定和N端测序的流程

    质谱鉴定和N端测序的流程(Vecchi M M et al. 2019)

    化学标记结合质谱
    N端序列分析的许多研究方法都结合使用了质谱技术以及各种化学方法和生物酶方法,例如,蛋白质被侧链氨基的还原、烷基化和胍基化封闭。用不同的生物素试剂标记游离的N端,用胰蛋白酶消化标记的蛋白质后,用抗生物素蛋白亲和系统分离被标记的N端肽,然后通过MALDI-TOF/MALDI-TOF-PSD MS从头测序获得N端肽的序列。

    N端测序的未来发展

    随着经典方法、基于质谱的各种化学修饰以及酶辅助技术的不断发展和完善,蛋白质和多肽的N端序列分析获得了丰富的末端肽序列信息,为加速蛋白质药物高级结构的鉴定和修饰位点的研究提供了有力的基础。复杂生物系统中成千上万种蛋白质的N端序列分析技术仍然是我们面临的巨大挑战,尤其是对于更大规模地详细确定N端修饰多样性而言,还需要更具针对性的研究策略。未来的发展方向可能是探索选择性更好、修饰更可控的化学修饰试剂和修饰条件。

    参考文献

    1. John Bryan Smith. Peptide Sequencing by Edman Degradation. Encyclopedia of Life Sciences,2001.
    2. Vecchi M M, Xiao Y, et al. Identification and Sequencing of N-Terminal Peptides in Proteins by LC-Fluorescence-MS/MS: An Approach to Replacement of the Edman Degradation. Anal Chem, 2019, 91(21):13591-13600.
    3. Misal S A, Li S, et al. Identification of N-terminal protein processing sites by chemical labeling mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom, 2019;33(11):1015-1023.

    相关服务

    基于Edman降解的蛋白质N端测序
    基于质谱的序列分析

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