如何通过质谱技术检测蛋白的乙酰化修饰？

蛋白乙酰化（Protein Acetylation）是最早被发现、也是研究最广泛的一类酰基化修饰，尤其是赖氨酸乙酰化（Lysine acetylation, Kac）。它广泛存在于核、质和线粒体蛋白中，在转录调控、染色质重构、代谢调节等生物过程中发挥关键作用。随着质谱（Mass Spectrometry, MS）技术的发展，研究人员得以从全组学层面对乙酰化修饰进行高通量、定量和位点特异的分析。

一、赖氨酸乙酰化修饰的特点及检测难点

1、修饰位点多样：广泛分布在转录因子、组蛋白、代谢酶等蛋白上；

2、丰度低、动态性强：Kac修饰在总蛋白中的丰度极低（<0.1%）；

3、质量偏移明确：+42.0106 Da，可被高分辨质谱清晰捕获；

4、位置特异性要求高：需要精确定位于特定赖氨酸位点。

因此，高灵敏度和高特异性的检测策略是成功研究Kac的关键。

二、乙酰化修饰质谱检测的标准流程

1、蛋白提取与酶解

• 使用含脱乙酰酶抑制剂的裂解缓冲液（如Trichostatin A, Nicotinamide）保护内源性修饰；

• 建议使用8 M Urea或SDS裂解体系提取蛋白；

• 常规使用Trypsin进行蛋白酶解，生成可供富集与检测的肽段。

2、乙酰化肽段富集（关键步骤）

由于乙酰化修饰的低丰度，必须先富集后检测：

常用方法：抗乙酰赖氨酸抗体富集（Anti-Kac IP）

• 利用抗体特异识别乙酰化赖氨酸的共价结构；

• 适用于多种样本类型（细胞、组织、临床样本）；

• 可串联富集不同亚细胞组分或修饰类型（如结合TMT标记）。

3、LC-MS/MS 质谱检测

（1）液相色谱分离：NanoLC系统提高分辨率，推荐使用C18反相色谱柱；

（2）质谱平台推荐：

• 高分辨Orbitrap系列（QE HF-X、Exploris 480）；

• timsTOF Pro 2适用于DIA采集模式；

（3）采集模式：

• DDA（数据依赖采集）：适合修饰位点图谱构建；

• DIA（数据非依赖采集）：适合大样本定量分析；

（4）质谱参数设置：

• 预设乙酰化修饰为可变修饰（K+42.0106）；

• MS/MS级别扫描用于确认修饰位置；

• 动态排除避免重复扫描高丰度肽。

4、数据分析与修饰定位



数据分析流程：

（1）数据库搜索：UniProt物种数据库，设定Kac为可变修饰；

（2）位点定位：使用ptmRS或Ascore算法评估修饰可信度（通常要求置信度 ≥ 0.75）；

（3）定量分析：

• 标签定量：TMT、iTRAQ 等；

• 无标记定量：LFQ、MS1峰面积。

三、进阶策略：提升乙酰化修饰组学分析的深度与通量



四、蛋白乙酰化研究的热门应用领域



质谱技术已成为蛋白乙酰化修饰研究的核心手段。通过科学的样本制备、特异的抗体富集、高分辨率的质谱检测与严谨的数据分析流程，科研人员可以实现对乙酰化修饰的高通量、位点特异和动态定量的全面解析。百泰派克生物科技已构建成熟的蛋白乙酰化组学分析平台，从样本处理、抗体筛选到定量策略全面优化，支持多种模式动物与细胞系，广泛应用于代谢调控、药物靶点发现、疾病机制研究等方向。如您对蛋白乙酰化修饰研究感兴趣，欢迎联系获取完整实验方案或案例报告，我们将为您提供一对一技术支持与免费评估服务！

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