Activity-Based Protein Profiling实验流程及操作要点

Activity-Based Protein Profiling（ABPP）实验流程涉及从探针设计、样本处理，到信号检测和数据分析的多个关键步骤。以下是标准ABPP实验流程及每一步的操作要点，适用于大多数酶类研究（如丝氨酸酯酶、蛋白酶、脱酰化酶等）。

 

一、ABPP实验流程概览

1、活性探针准备

2、样品制备（细胞、组织或纯化酶）

3、探针标记（incubation）

4、富集或分离（可选）

5、分析检测（SDS-PAGE/Western blot 或 LC-MS/MS）

6、数据分析（定性或定量）

 

二、各步骤详解与操作要点

1、活性探针设计与准备

（1）组成结构：

• Warhead：选择能与靶酶活性位点共价结合的反应基团（如氟磷酸酯、氯甲基酮等）。

• Linker：可调控空间构象，避免干扰酶识别。

• Reporter Tag：可为荧光基团、生物素、放射性标签，或“click chemistry”接头（如alkyne）。

（2）操作要点：

• 根据靶酶催化机制设计反应基团。

• 若用于LC-MS，推荐使用小分子标签或“click”探针，便于后续纯化和检测。

 

2、样品制备

（1）类型：

细胞裂解液、组织匀浆、血清、纯化酶、活细胞、动物组织等。

（2）操作要点：

• 保持酶活性：裂解液中需含适当缓冲液（常用PBS、Tris-HCl），避免强变性剂和高浓度去污剂。

• 预清洗：清除背景干扰蛋白。

• 保持冷链：使用低温（0–4°C）制备，加入蛋白酶抑制剂（避开靶酶类抑制剂）。

 

3、探针标记（Incubation）

（1）条件优化：

• 探针浓度：通常在 0.1–10 μM 范围。

• 时间：10–60分钟。

• 温度：常为 37°C，部分细胞实验可在 室温或4°C 进行以降低非特异性标记。

（2）操作要点：

• 可设对照组：如未处理、热灭活样本或加入已知酶抑制剂。

• 竞争性ABPP：加入小分子抑制剂预处理样品，检测其是否能竞争性阻断探针结合。

 

4、富集（可选）

适用于非荧光标签，如带有生物素/alkyne的探针，需点击反应和亲和纯化。

（1）操作：

• Click Chemistry：alkyne + azide-Cy5/biotin，在Cu(I)催化下点击。

• 富集方式：链霉亲和素磁珠拉下（biotin-labeled probe）。

（2）要点：

• 反应缓冲液需氧化还原控制良好。

• 使用磁珠洗脱样本时注意避免非特异性结合。

 

5、分析检测

  

常见方法	说明
SDS-PAGE+荧光扫描	适用于荧光标签探针；快速、直观。
Western Blot	如探针为生物素，需用HRP-或荧光标记链霉亲和素检测。
LC-MS/MS	与亲和纯化结合，定性+定量分析酶活性谱；高通量但耗时高。

 

要点：

（1）蛋白定量应准确，确保每组样品上样量一致。

（2）对质谱样品应酶解、脱盐、纯化后上机。

 

6、数据分析

依据实验类型：

（1）定性：酶种类识别、蛋白识别率（如ABPP-MS）。

（2）定量：通过同位素标记（SILAC、TMT）、标签自由（LFQ）等方法评估酶活性变化。

（3）图像分析：荧光凝胶可用 ImageJ 进行条带强度分析。

 

三、关键操作注意事项总结

  

项目	要点
控制组设置	必须设置空白组、竞争组、抑制剂组，确保特异性。
酶活性保持	样本处理全过程避免极端pH、变性剂、热处理。
探针优化	选对warhead和标签；不同酶类不能通用探针。
非特异性降低	使用适当封闭剂、加竞争底物、温度控制。

 

ABPP（Activity-Based Protein Profiling）将化学探针与蛋白质组学相结合，能够在复杂生物样本中特异性检测活性酶，揭示其功能状态和调控机制。通过合理设计活性探针、优化样本处理与标记条件，并结合高效的检测手段（如荧光成像或质谱分析），ABPP不仅可用于酶功能研究和药物靶点鉴定，也在疾病机制探索和临床标志物发现中展现出巨大潜力。掌握其实验流程与关键操作要点，将为深入开展功能蛋白质组学研究提供坚实基础。

 

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