从实验到数据分析：一步步教你开展ABPP实验
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提取细胞/组织蛋白，保持酶活性
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与探针混合孵育（30–60 min）
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终止反应并进行下游处理
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直接在活细胞中添加探针
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反应完成后快速裂解
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捕获在原位状态下的酶活性图谱
与蛋白组学方法不同，ABPP（Activity-Based Protein Profiling）不仅能识别蛋白的表达，还能捕捉其“活性状态”，尤其适用于如蛋白酶、磷酸酶、脱酰化酶等调控复杂的功能蛋白。那么，如何系统地开展一次完整的ABPP实验？从探针选择到质谱分析，从样本处理到数据解读，本文将一步步带你拆解ABPP实验的完整流程，为你的研究提供清晰、高效的操作指南。
一、ABPP实验的完整流程
1、确定研究目标与酶类家族
开展ABPP实验的第一步是明确研究目标：你希望分析哪类酶？在哪种生物模型或处理条件下进行？常见的目标包括：
（1）筛选肿瘤中活性异常的蛋白酶
（2）验证候选药物对目标酶的作用
（3）分析炎症或凋亡信号通路中活性酶的调控模式
不同的酶类需要设计或选择特异性的ABP（Activity-Based Probe），因此目标酶的确定决定了后续的探针策略和数据分析路径。
2、选择或定制活性探针（ABP）
ABP 是 ABPP 成功的关键工具，结构上一般由以下三部分组成：
3、探针标记ABPP实验样本
标记实验的执行步骤主要分为两种模式：
（1）细胞裂解液标记（in vitro）
适用于酶筛选或药物作用机制研究。
（2）活细胞或组织标记（in situ/in vivo）
更接近生理状态，但需注意探针通透性和毒性。
4、富集与酶解
标记完成后，下一步是将被标记的“活性酶”从复杂背景中富集出来：
（1）若使用生物素标记 → 使用链霉亲和磁珠进行亲和纯化
（2）若使用点击基团 → 进行点击反应后连接到富集载体（如Biotin-Azide）
富集完成后，用胰蛋白酶（Trypsin）等进行标准蛋白酶解反应，为后续质谱检测准备肽段。
5、质谱检测（LC-MS/MS）
样本准备好后，进入高分辨率质谱分析阶段。建议使用如下策略：
（1）仪器平台：如Orbitrap Exploris 480，适合高通量、高精度需求
（2）分离方式：纳升级反相色谱（nanoLC）可提升肽段分离能力
（3）检测模式：可选择DDA（数据依赖采集）或DIA（数据独立采集）
（4）定量方法：支持Label-Free、TMT、iTRAQ等多种定量策略
此阶段获取的ABPP实验原始数据为后续构建活性图谱提供核心信息。
6、数据分析与活性谱图绘制
ABPP的最终目标是生成一份活性蛋白图谱。数据分析流程主要包括：
（1）肽段鉴定与定量
利用专业软件（如MaxQuant、Proteome Discoverer）进行肽段识别、定量。
（2）特异性筛选
只保留已成功标记（被探针捕获）的蛋白，去除背景信号。
（3）活性变化分析
比较不同处理组（如药物处理 vs 对照）的酶类活性水平差异，常用log2 fold change + FDR筛选。
（4）功能注释与通路富集
结合GO、KEGG、Reactome数据库，对高活性或差异酶类进行功能分类与通路分析，提炼生物学意义。
（5）图谱展示
输出蛋白酶活性热图、分子互作网络、通路富集图等，辅助撰写论文或申请专利。
二、常见问题解答（FAQ）
Q1：ABPP实验可用于哪类蛋白？
主要用于具有活性位点、可被探针共价修饰的酶类蛋白，如蛋白酶、磷酸酶、泛素化酶等。
Q2：探针非特异性如何解决？
可通过空白组+竞争抑制组进行背景去除，并优化探针浓度与反应时间。
Q3：数据重复性如何保证？
推荐进行≥3次生物学重复，同时采用TMT等方法减少批次效应。
三、百泰派克生物科技：ABPP全流程一站式服务平台
为降低ABPP实验的技术门槛、提升实验成功率，百泰派克生物科技提供以下服务：
1、多种活性探针筛选与合成（支持定制化设计）
2、全流程实验操作（从样本处理到富集酶解）
3、高分辨质谱检测与分析
4、差异蛋白活性分析、通路注释与图谱输出
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ABPP的价值在于，它不仅揭示蛋白的“在”与“不在”，更回答“活着的，正在起作用的，是谁”。掌握ABPP，不仅是掌握一种技术，更是打开了理解蛋白质功能状态和精准靶点发现的大门。欢迎联系百泰派克生物科技，获取ABPP实验流程的专业培训与项目支持，助您从表达组跨越到功能组！
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