蛋白质翻译后修饰分析策略

早期蛋白质组研究的大部分工作集中在细胞生长的不同时期,或疾病或有丝分裂原刺激后的蛋白质表达水平的变化。然而,许多生命过程不仅受蛋白质的相对丰度控制,还受时空分布可逆的翻译后修饰控制。因此,揭示翻译后修饰的规律是了解蛋白质复杂性和多样的生物学功能的前提。蛋白质的翻译后修饰是一个复杂的过程。目前,发现的最常见的修饰类型是糖基化、泛素化和磷酸化。

蛋白质翻译后修饰分析策略

蛋白质翻译后修饰分析策略

样品中翻译后修饰蛋白质含量低、动态范围广给相关研究带来了很大的挑战。基于翻译后修饰蛋白的异质性和相对丰度低的特点,主要利用凝胶、生物质谱和生物信息学工具对其进行研究。用于PTM分析的质谱方法类似于用于“常规”蛋白质鉴定的方法,包括自下而上、自中而下和自上而下的蛋白质组学分析。

翻译后修饰自下而上分析策略

自下而上蛋白质组学是一种基于肽段分析的技术。对于不同类型的翻译后修饰,具体的分析策略存在差异。

糖基化

蛋白质的糖基化具有异质性。不同的糖链可以连接到同一位点上,不同位点可以连接到同一蛋白质上的不同糖链上。糖基化的异质性严重阻碍了糖蛋白的分离和分析。不同糖类型的相同蛋白质,在电泳上会出现分散的条带,导致信号分散。此外,对低丰度蛋白质的识别性差导致糖蛋白在色谱图中分离不佳,质谱中有一簇分子量不准确的分辨不清的峰。

目前,蛋白糖基化研究的主要策略是利用现有的技术体系对糖基化蛋白的糖基化肽段进行分离和富集,消除糖基化的异质性及其对质谱的影响,标记糖基化位点。从而实现高通量糖蛋白和糖基化位点的识别。常用的糖蛋白分离和富集技术有:a. 凝集素亲和技术;b. 肼化学富集;c. 亲水性相互作用色谱法;d. β-消除/迈克尔加成反应。基于质谱的糖蛋白鉴定和糖基化位点测定方法有:a. PNGase F酶法;b. Endo H酶法;c. 三氟甲烷磺酸(TFMS)法。

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糖基化定量蛋白组学研究

泛素化

泛素是一种由76个氨基酸组成的多肽,在真核生物中高度保守,可通过异肽键与目标蛋白赖氨酸残基的氨基进行共价连接。泛素化蛋白的富集主要基于标记,泛素用亲和标签(通常为6xHis)进行标记,并通过镍螯合色谱亲和提取泛素化蛋白。由于泛素的C端为Arg-Gly-Gly结构,经胰蛋白酶水解后,Gly-Gly保留在修饰蛋白的肽链上,使肽的质量增加114,因此可作为泛素定位位点的质量标记。用HPLC对样品进行预分离,使用针对特定残留结构的抗体富集泛素化肽,可大大提高泛素化蛋白的浓度。串联质谱可以鉴定泛素化位点。

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泛素化定量蛋白组学研究

磷酸化

磷酸化蛋白质组的研究主要集中于真核生物中普遍存在的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化。由于活体内磷酸化蛋白的含量很低,因此在分析前必须对其进行分离和富集。目前,常用的磷酸化蛋白质的分离和富集技术包括固定化金属亲和色谱(IMAC)、免疫沉淀(IP)、强阳离子交换(SCX)色谱、强阴离子交换(SAX)色谱、反相色谱等。这些技术被整合和优化用于不同生物样品的磷酸化蛋白质组分析。

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磷酸化定量蛋白组学研究

翻译后修饰分析自中而下分析策略

自中而下的蛋白质组学技术可用于组蛋白修饰的分析。样品制备与广泛使用的自下而上的分析策略相同,直到得到纯化的组蛋白。提取组蛋白后,用GluC进行消化。然后用弱阳离子交换/亲水相互作用色谱(WCX-HILIC)与配备电子转移解离(ETD)的高分辨率质谱联机联用,对样品进行理想的分离。谱识别可以用传统的软件进行,但是由于估计适当的错误发现率的问题,需要对结果进行过滤。

翻译后修饰分析自上而下分析策略

自上而下的技术可以直接引入完整的蛋白质并在串联质谱仪上对其进行片段化,不需要蛋白质水解消化。目前,有两种完全分离蛋白质的方法:离线和在线。前者用四维分离法,后者用WCX-HILIC。

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