SDS-PAGE如何工作

电泳是分离蛋白质和核酸、嘌呤、嘧啶、一些有机化合物甚至无机离子等物质的主要技术。大多数电泳方法是将样品在一个固定化的介质中进行分离。聚丙烯酰胺凝胶是主要的介质之一。聚丙烯酰胺是一种多孔凝胶,孔径接近蛋白质分子的大小,从而提高了蛋白质的分辨率。此外,聚丙烯酰胺凝胶还具有良好的化学稳定性、强重复性、对pH和温度变化的稳定性,颜色易于观察等优点。十二脘基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrohoresis,SDS PAGE)在确定蛋白质分子量,检测特定蛋白质和鉴定菌株种类方面具有操作简单和重复性好的优点。

SDS-PAGE的原理

聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵(AP)和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)的作用下形成。它是一种具有三维网状结构的凝胶。PAGE可以根据蛋白质分子的电荷和分子量不同引起的不同迁移率,将蛋白质分为若干条带。SDS是一种阴离子表面活性剂,可以在还原剂(β-巯基乙醇或二硫苏糖醇,DTT)存在下破坏蛋白质的氢键和疏水键,并与蛋白质分子按一定比例结合,形成等密度的短杆状复合物。不同分子量的蛋白质形成的复合物长度不同,复合物长度与蛋白质的分子量呈正相关。SDS使蛋白质带负电荷的数量远远超过其原始电荷,从而掩盖了各种蛋白质分子之间的自然电荷差异。因此,电泳过程中各种蛋白质-SDS复合物的迁移率不再受原始电荷和分子形状的影响,而仅取决于相对分子质量。

聚丙烯酰胺凝胶通常由上层的浓缩胶和下层的分离胶组成。浓缩胶和分离胶之间的差异在于丙烯酰胺的浓度和Tris-HCl的pH。在电泳过程中,向凝胶施加电场,带负电荷的蛋白质跨凝胶从负极迁移到正极。最常见的电泳缓冲液由Tris和甘氨酸组成。浓缩胶的pH为6.8,只有少数甘氨酸分子解离。因此,经SDS处理的蛋白质分子在上部甘氨酸分子和下部Cl-离子之间移动。该过程将凝胶中的蛋白质样品压缩成比最初装载的体积小得多的条带。随着电泳的进行,蛋白质移至分离胶(pH 8.8),甘氨酸分子在此处解离,其移动速度增加并超过蛋白质。在分离凝胶中,每个蛋白质的移动速度取决于其分子量。分子量小的蛋白质可以很容易地通过凝胶中的孔,而分子量大的蛋白质则很难通过。一段时间后,蛋白质会根据其分子量的大小迁移至不同距离,从而实现蛋白质的分离。

凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳示意图(Gülay, et al.,2018)

如何通过SDS-PAGE确定蛋白质的分子量?

SDS-PAGE是确定未知蛋白质分子量的主要方法。已知分子量的蛋白质和未知样品同时电泳。染色后,根据标准蛋白质的相对迁移率和分子量的对数,可得到一条线,利用其相对迁移率确定未知样品的分子量。在实验室中,将一个与染料共价偶联的标准分子量蛋白质用作参考蛋白质,以大致指示未知蛋白质的大小。这种预先染色的蛋白质标记可以在电泳过程中或转移膜时直接观察到。

如何读取SDS-PAGE的结果?

电泳后,肉眼无法直接观察到蛋白质分离,需要后续的染色技术。考马斯亮蓝染色和银染是电泳分离蛋白质常规检测和定量的常用方法。经过简单的处理,如固定-染色-脱色,可以清楚地观察到蛋白质的分布。随着高灵敏蛋白质分析方法和蛋白质鉴定技术的改进,荧光标记和同位素标记技术等新的染色方法大大提高了灵敏度,并且还与自动蛋白质组学平台凝胶切割技术兼容,开发了更高的灵敏度和自动染色技术。

如何储存SDS-PAGE凝胶?

通常在每次实验之前会准备新鲜的SDS-PAGE凝胶。但是,凝胶也可以在4°C的清水中储存大约一周。如果在染色后无法及时拍照,则需要将其放入水中以防止凝胶干燥和收缩。建议尽快拍摄染色结果。如果将凝胶长时间浸泡在水中,条带会散开。

参考文献
1. Smith B J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in Molecular Biology, 1984, 1(4):41-55.
2. Duffy M F, Noormohammadi A H, Baseggio N, et al. Polyacrylamide gel-electrophoresis separation of whole-cell proteins. Methods in Molecular Biology, 1998, 104:267.

相关服务

基于SDS-PAGE的蛋白分离

How to order?

客服咨询

提交需求

关注公众号

促销活动