蛋白质质谱鉴定前样品制备注意事项

随着高分辨率质谱仪分析技术的发展，蛋白质质谱鉴定的方法已经相当纯熟，一次性鉴定多个蛋白样品，以及低丰度蛋白样品已经不再是难事。但是因为质谱的灵敏度高，外来引入的蛋白质可能会造成质谱鉴定的假阳性，因此，在蛋白样品的准备过程中要注意避免引入外来蛋白污染物。另外，蛋白样品的准备也需要使用与质谱仪检测兼容的溶液和试剂，这样可以极大提高质谱仪鉴定的准确度。在这期小编就来给大家介绍蛋白质质谱鉴定前的样品准备注意事项。

1. 蛋白质样品制备和质谱鉴定流程



蛋白质质谱分析一般流程

蛋白质质谱鉴定的一般流程
1. 首先对细胞或组织样品进行破碎，破碎的方法有很多种。大多数细胞可以通过选用常用的细胞裂解试剂，例如RIPA buffer，添加蛋白酶抑制剂和还原剂，来裂解细胞。组织则可以通过低温匀浆，液氮冷冻研磨等方法破碎组织细胞。
2. 接着12，000 rpm，4度高速离心10分钟，去除不可溶的细胞组分
3. 液体蛋白样品可以使用抗体进行富集，提纯，以及IP处理，再浓缩待检测的蛋白；也可以使用1D/2D-PAGE gel分离蛋白。
4. 浓缩后的液体蛋白经过酶切后，再使用LC-MS/MS分析；蛋白胶样则需要切下与目的蛋白分子量一致的蛋白条带，再对蛋白进行in-gel酶切和质谱检测分析。
5. 对质谱鉴定的数据进行分析获得可信度高的蛋白肽段序列，再与蛋白数据库进行比对获得蛋白质ID


2. 样品类型

细胞样品：动物细胞，植物细胞，真菌和细菌等微生物细胞

组织样品：动物组织，植物组织

体液样品：血清、血浆、尿液等


3. 样品用量



4. 注意事项

4.1. 浓缩样品:

蛋白质样品可以用沉淀，膜分离，分离柱，冷冻干燥等各种方式进行浓缩， 用户应根据样品的特点选择合适的方法共列，用SDS样品液可以从色谱样上中洗脱蛋白，从而保持样本体积小。
4.2. 电泳凝胶:

对于SDS- PAGE，传统的Laemmli式，三甘氨酸凝胶及其各种改进型的凝胶，如二，三凝胶或三盐酸凝胶， 都可以兼容于蛋白质鉴定。各种凝胶浓度也没有限制。用户选择凝胶的类型和浓度液，应根据对样本的分离效果好来决定。
4.3. 蛋白胶染色：
• Coomassie Blue, SYPRO Ruby 以及Silver stain样品均可进行蛋白的鉴定试验；
• 银染的样品有可能与后续的质谱分析不兼容，我们推荐您使用下面的产品或者实验步骤进行银染实验：

ProteoSilver Plus, Sigma (Product # PROTSIL1 or PROTSIL2)

Dodeca Silver Stain, BioRad (Product # 161-0481 or 161-0480)
• 另外，银染的样品请不要进行脱色处理
4.4. 液体样品：

样品准备过程中尽量减少SDS等表面活性剂的使用，并注意降低盐浓度。如果您提交IP洗脱样品，我们推荐使用HPH EB (0.5 M NH4OH, 0.5 mM EDTA) 缓冲体系进行last step蛋白的洗脱，保证洗脱缓冲体系与后续的质谱实验兼容。
4.5. 切割蛋白带:

凝胶在切割过程中应避免与手，灯箱， 或任何其他可能的角蛋白污染源直接接触。在切割蛋白胶带适应尽量避免割下空白凝胶（它可能会降低酶切的消化效率和多肽的回收率）。 将每个凝胶带置于干净的，1.5毫升的微型离心管并给每个样本小心地做上标签。