蛋白分析FAQ汇总

• • 如何准备和提交用于蛋白质分子量测定的样品？

  样品推荐： 建议样品体积中至少含有300pmol的蛋白质，在30μM的浓度下，体积约10μL，当然样品中所含蛋白质越多越好。样本应该是纯的，否则解卷积可能不起作用。 去污剂与质谱不兼容，必须在分析前从缓冲液中除去。去除缓冲液中的所有聚合物或去污剂（例如TritonX、NP-40、SDS或类似

• • 我该如何选择蛋白质样品LC-MS/MS分析的运行时间？

  如果您的蛋白样品只含单一蛋白质或含多达50个等摩尔质量的蛋白，并且需要进行蛋白质鉴定，则30分钟的运行时间就足够了。 如果您是IP样品，并期望检测出约100种蛋白质，那么我们建议60分钟的运行。 如果您期望寻找翻译后修饰位点（PTM），我们建议至少运行60分钟。 如果您的样品是含有数百种蛋白

• • 提交蛋白质样品进行质谱鉴定需要做什么？

  对于单个蛋白凝胶条带： 采用小型凝胶进行电泳并进行考马斯亮蓝染色。也可以使用SYPRO™ Ruby进行染色，但银染条带可能不能涵盖足够的蛋白质用于鉴定。通过与已知浓度的标记物进行比较来预估条带中的蛋白含量。染色时间不得超过15分钟。如果将凝胶染色太久，染料碎片会影响后续脱盐步骤。用干净的手术

• • 如何鉴定特异性修饰位点？

  我们需要您提供修饰后增加的确切质量以及目标蛋白的确切序列。相关服务:蛋白质翻译后修饰

• • 在研究磷酸化、乙酰化等翻译后修饰（PTM）时，如何制备样品？

  对于这类研究项目，我们通常采用3种酶的方法开展。即用3种不同的酶进行消化，以确保全范围覆盖。我们要求用户对感兴趣的目标条带进行3个泳道的电泳，并将3个泳道的蛋白条带收集到一个试管中。相关服务:蛋白质翻译后修饰

• • 如果想要进行N端/C端测序或蛋白质修饰鉴定，对样品有什么要求？

  我们需要您提供样品蛋白所有标签和修饰的确切序列。相关服务:蛋白质N/C端测序

• • 我应该提交多少蛋白质进行蛋白质鉴定或定量?

  对于溶液内消化样品的LC-MS/MS分析，所需的样品蛋白是基于BSA校准的Bradford法测定蛋白质的10倍，当然，也可以减少蛋白加样量，即在每次运行时将1 ug总蛋白注入到检测系统中，但由于制备过程中的样品损失而需要超量。 对于凝胶条带，如果是考马斯染色的凝胶上的可见条带，我们的阳性识别

• • 如何决定对裂解物或免疫沉淀物以溶液还是凝胶条带形式的样品进行分析?

  对于Label free非标定量分析，我们通常使用溶液内消化来限制样品间的变化量。用溶液样品进行消化和后续分析，还可以最大数量的获得蛋白定性“组分表”。该方法有助于避免因凝胶提取效率而产生的偏差，并在样品很少的情况下提高样品的原始灵敏度。因此，我们可以对蛋白质含量低至0.1 ug的样品进行溶

• • 我可以在什么缓冲液体系中提交样品?

  凝胶条带 样品应在4℃下储存在含有50 mM AmBic或水溶液的1.5 mL eppendorf管中。 溶液 样品应储存于含有0.1-0.5%Waters RapiGest 质谱兼容洗涤剂的50 mM碳酸氢铵中。相关服务:样品处理

• • 定性鉴定免疫沉淀和/或标记的蛋白质样品的未知磷酸化位点可以直接使用SDS-PAGE凝胶样品进行研究吗？还是使用溶液样品?

  用溶液样品开展研究是首选方法；但是，如果需要，也可以直接从SDS-PAGE凝胶条带样品中进行分析。 *注意：磷酸酶抑制剂（如 KF 和原钒酸钠）可以与LC-MS富集技术兼容，这些成分应在样品预处理过程加入。相关服务:磷酸化定量蛋白组学