蛋白分析FAQ汇总

• • 对于磷酸化蛋白质的蛋白质印迹，我可以使用1X PBST进行洗涤吗？

  不应使用 PBS-T对磷酸化蛋白进行印迹，而应改用TBS-T。相关服务:蛋白质免疫印迹和电转移服务

• • 是否可以使用化学发光同时检查膜中的2种抗体（靶蛋白和管家蛋白）？

  理论上是可以的，如果蛋白质的分离大小非常好、具有不同的大小，并且蛋白质-抗体结合是特异性的。相关服务:蛋白质免疫印迹和电转移服务

• • 怀疑切片凝胶带可能含有许多蛋白质，我怎么知道哪种蛋白质是目标蛋白？

  这是我们每天都会面临的一个非常普遍的问题。如果您有蛋白质混合物，并且许多蛋白质的分子量范围都很接近预期，它们都将存在于您提交给我们进行测序的切片凝胶片中。在这种情况下，机器将识别所有蛋白质。切片凝胶片中蛋白质的相对丰度将反映在结果分数和蛋白质覆盖率中。通常，切片凝胶中的含量较高的蛋白质在数据

• • 我想鉴定感兴趣蛋白质的磷酸化，成功进行质谱分析需要多少蛋白质？

  任何考马斯亮蓝染色条带都可以通过我们的高灵敏度质谱机器在 MS 和 MS/MS 水平上进行鉴定。如果蛋白质样品的浓度约 100 fmole/μl，则每条泳道上样 10μl 应该会产生每条泳道大约 1pmol 的蛋白质。>1 pmol 的蛋白质条带可以通过几种类型的染色剂（考马斯胶体、Zn、C

• • 与MALDI-TOF/TOF相比，nano-ESI MS/MS有何优势？

  我们利用色谱梯度根据肽混合物的疏水性分离它们。这降低了肽混合物的复杂性，并在机器运行期间执行数千次 MS 和 MS/MS 扫描。在 MS/MS 测序之前，机器有足够的时间在离子阱中富集肽。通过这种方式，不仅蛋白质的覆盖率会增加，而且能比 MALDI-TOF/TOF 产生更好的质量数据。在 M

• • 样品是液体形式，成功进行质谱分析需要多少蛋白质？

  这实际上取决于实验类型。通常，我们使用 10-15 cm 长色谱柱时一次上样 0.5-1 µg 肽混合物，使用 50 cm 长色谱柱时上样 1-2 µg 肽混合物。如果蛋白质有足够的量，我们建议用胰蛋白酶消化至少 50 µg 蛋白质。请与我们讨论您的样品制备方案，以避免可能干扰蛋白质消化和质

• • 与基于凝胶的技术相比，基于溶液的蛋白质组分析有什么优势？

  如果您的样品复杂程度较低，我们建议您在 SDS-PAGE 凝胶上运行它们，以去除污染物和质谱干扰物质。只需短时间运行，让蛋白质混合物进入浓缩胶并浓缩为一个粗条带。但并非所有蛋白质都能在 SDS-PAGE 凝胶中得到很好的分离，尤其是膜蛋白。如果您使用与蛋白质组学兼容的裂解缓冲液制备复杂的细胞

• • 接近 100% 的同位素掺入细胞蛋白质组所需的典型标记周期是多少？

  几乎完全重同位素掺入所需的细胞倍增次数通常为 5-6。许多细胞系（例如，HeLa、HEK293）已经证明了这一点。相关服务:基于SILAC/Dimethyl标记的定量蛋白组分析

• • 在 SILAC-MS 实验中如何防止 L-Arg 转化为 L-Pro？

  应该采取一些程序性措施来帮助减少这种不利的代谢反应。有关执行 SILAC-MS 实验的最佳实践的设计说明和提示/技巧，请参考 Mann 等人的Nature Protocols文章 ( PMID: 17406521 )。相关服务:基于SILAC/Dimethyl标记的定量蛋白组分析

• • 三重SILAC 实验中通常使用哪些稳定同位素标记试剂？

  三重 SILAC-MS 实验通常使用以下三种同位素标记状态的 L-Lys 和 L-Arg：1）light(L)， 未标记的 L-Arg (ULM-8347) 和未标记的 L-Lys (ULM-8766)；2）medium (M)， 13C6 L-Arg (CLM-2265) 和 D4 L-