蛋白分析FAQ汇总

• • 我应该用磷酸酶抑制剂制备样品吗？

  使用磷酸酶和蛋白酶抑制剂，并将样品放在冰上，以在样品制备过程中抑制蛋白质降解并保护翻译后修饰。相关服务:磷酸化定量蛋白组学研究

• • 分析色谱和制备色谱的区别是什么？

  分析色谱用于确定样品中分析物的存在以及可能的浓度。例如，通过尺寸排阻色谱估计抗体样品中的聚集体/二聚体含量。 制备色谱用于纯化足够量的物质以供进一步使用，例如用于功能或结构研究。相关服务:蛋白质质谱鉴定

• • 我感兴趣的蛋白质在纯化过程中“消失”了，我该怎么办？

  1.蛋白质可能被蛋白酶降解了。解决方法：向样品和缓冲液中添加蛋白酶抑制剂，以防止蛋白水解消化。通过Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow等介质运行样品以除去胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。 2.在样品制备过程中，蛋白质被吸附到过滤器中了。解决方法：使用不同膜类型的过滤器。

• • 为什么我的SEC的分辨率很低？

  许多因素都会影响尺寸排阻色谱（SEC）的分辨率，例如介质的粒度、色谱柱长度和样品体积。 但另一个可能不太明显的方面是液相色谱（LC）系统本身的贡献。重要的是要尽量减少系统中的死体积，例如通过使用短而窄的管道并移除系统流路中所有不必要的组件。相关服务:蛋白质纯度分析（分子筛/反相色谱）

• • western blotting和far-western blotting有什么区别？

  蛋白质印迹（western blotting）用于检测蛋白质，而far-western blotting用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。这是通过在western blotting中使用抗体进行蛋白质检测，而在far-western blotting中使用蛋白质探针来完成的。在western

• • Co-IP和GST-pull down有什么区别？

  免疫共沉淀（Co-IP）实验是在非变性条件下进行的，可以最大限度地保持蛋白质之间相互作用的天然活性。因此，Co-IP可以很好地原位反映蛋白质的真实相互作用。然而，仅使用Co-IP，我们不能确定蛋白质相互作用是直接的还是间接的。通过靶蛋白抗体免疫共沉淀后，得到一种蛋白质复合物，它不仅含有与靶蛋

• • 免疫沉淀实验中出现了非特异性结合怎么办？

  使用更严格的洗涤缓冲液进行洗涤。 向洗涤缓冲液中加入浓度在0.01-0.1之间的非离子洗涤剂（吐温-20或Triton X-100）。 如果珠子在沉淀前被封闭，请在洗涤缓冲液中加入相同的封闭剂。 增加洗涤步骤数或延长洗涤步骤。 减少孵育时间（珠子和样品）。 降低抗体浓度。 采用预清除步骤，以

• • 哪些类型的洗涤剂可以与LC-MS分析结合使用？

  大多数洗涤剂会导致色谱分离不理想。然而，这些化合物可能是最佳样品制备所必需的。这正是我们在流程中实施使用洗涤剂去除柱的原因。您可以查看色谱柱规格，了解可以安全使用的洗涤剂及浓度。相关服务:蛋白质质谱鉴定

• • 你们有下拉（pull down）实验的流程吗？

  有许多不同的选择可以很好地进行下拉实验。为了对下拉的蛋白质进行最佳分析，我们建议选择一种实验设置，其中用于下拉的抗体保留在磁珠上而不会洗脱到样品中。大量的抗体可以抑制被拉下的蛋白质的信号。限制样品中的抗体存在的方法有：将抗体共价结合到珠子上；使用温和的洗脱缓冲液使抗体保持完整并结合在珠子上。

• • 在下拉（pull down）实验中需要避免哪些缓冲液成分？

  在下拉实验中使用NP-40等聚合物物质长期以来一直是其与LC-MS分析结合的一个大问题。聚合物电离化非常好，会干扰色谱分离和肽的电离。我们建议在实验中避免使用NP-40。 如果无法做到这一点，使用Pierce detergent removal columns也有助于去除痕量聚合物，或者另一