蛋白分析FAQ汇总

• • Skyline可以输入一个包含多行转换（超过excel限制 1,048,576 行）的大型库吗？

  可以的。我们已经在Skyline中成功搜索了一个目标列表，其中包含大约6,000,000条转换（包括目标和诱饵）。但这样越做越多是没有意义的，这将会失去一定的定量精度和准确性，从而降低定量灵敏度或通过推动越来越多的测量来增加定量假阳性率。若对于未完善的重复测量并使用它们来确定您应该在测量中使

• • 方法性能是否需要生物样品再分析(ISR)支持？

  监管机构对某些研究类型要求生物样品再分析(ISR)。然而，在某些情况下，我们会执行ISR实验，即使它们不是必需的，以便获得对特定方法或平台的信心。相关服务:样品处理

• • 我们如何克服干扰峰？

  生物分析中最常见的干扰之一是磷脂。这些可能会累积，然后随着时间的推移逐渐洗脱，导致基线漂移或出现意外峰。在最坏的情况下，这样的PL峰可以与一个化合物相互作用共洗脱和/或引起离子抑制。我们已经有效地使用锆技术来去除这些（同时去除蛋白质）。可通过改善萃取条件、改变色谱、尝试化学衍生化或使用更有选

• • 我们正在对生物标志物鉴定进行比较分级研究。我们应该使用 DDA 还是 DIA？此外，不同的仪器类型是否会对分析产生影响？

  我们会推荐 DIA（Data independent acquisition）数据非依赖性采集模式，因为它最终可以为定量实验产生更高质量的数据。不过，DIA可能工作量更大且需要对新技术进行学习。因此，我认为我们无法给出明确的建议。您需要根据实验室的资源和专业研究做出最终的决定。相关服务:DI

• • DIA肽检测和相关的FDR能否应用于全局而不是局部？这意味着每个目标和诱饵在所有重复项中只保留它们的最大z值来进行q值计算？

  我们已经在一个分支上实现了这种方法，然而，我们的实现需要更多的验证，因此，它目前还不可用，但我们希望这种技术更新与发展能很快到来。相关服务:DIA定量蛋白质组学

• • 库导入的假阳性率（FDR）是否在肽/蛋白质/肽谱匹配（PSM）级别计算？

  如果您指的是数据库构建的临界值，那么它不一定保证是FDR截止值。数据设置的截止值始终应用于搜索途径提供的最合适的概率值。对于PeptidePhrophet算法，该概率值是一个后验误差概率，它指示PSM本身的局部假阳性率。i.e.0.9意味着所有这样的匹配都可以预期为10次中的9次为真阳性。它

• • 当样品中未添加iRT mix时，您如何将Skyline应用于DIA技术？

  Skyline支持使用内源性肽作为iRT标准，Skyline一个很好的起点是使用CiRT肽——一组已发表的80多种存在于真核生物中的保守肽。Skyline将自动选择其中的一个子集，这些子集在在数据中可以很好地表达。曾有研究在2个体系中含3种生物有体混合数据集上取得了成功，一个是人类、酵母、大

• • 您能否解释一下为什么选中“Use DIA precursor window for exclusion”框？

  此复选框将导致Skyline排除用于从生成的MS/MS谱图中可接受的碎片离子目标组中分离母离子的质荷比（m/z）范围。例如，如果在四极杆设置为600到625的情况下分离前体，则在600到625范围内不允许进行碎片离子选择。假设肽的y8+碎片离子落在这个质荷比（m/z）范围内并且具有DDA谱库

• • 我们如何在预测库中导入？

  您现在可以通过定义目标列表的方法，然后使用 Peptide Settings - Library 选项卡中的 Build 按钮直接在 Skyline 中构建。这提供了对TUM的Prosit预测服务器的直接访问权，并将产生一个包含光谱和 iRT 预测的本地 Skyline 格式 (BLIB)

• • 如果我们不使用iRT肽段，我们能否定义自己的RT校准肽段？

  可以的。在过去的这段时间里，我们在简化此过程方面取得了很大进展，很多工作都有了改进。相关服务:DIA定量蛋白质组学