蛋白分析FAQ汇总

• • 可以使用 Trizol（Tri-reagent）进行多反应监测 (MRM) 质谱分析的蛋白质提取吗？

  可以。但在进行消化之前，您可能需要进行缓冲液交换。相关服务:MRM/PRM定量蛋白组学分析

• • 在胰蛋白酶消化前，可以通过离心柱对不同大小的蛋白质进行分离吗？

  离心柱通常用于脱盐，即从小分子中分离蛋白质（或其他大分子）。它们通常不用于分离不同的蛋白质。您可以使用 HPLC 或 UPLC 尺寸排阻色谱法，或自上而下的质谱法。相关服务:蛋白分析

• • 为什么抗磷酸酪氨酸抗体容易出现高背景和/或信号减弱的现象？

  检查是否是封阻出现问题。脱脂奶粉适用于所有蛋白印迹，但磷酪氨酸印迹除外，磷酪氨酸印迹具有与膜结合的磷酸化蛋白。用该试剂进行阻断会导致蛋白存在潜在的表位。稀释该溶液中的抗磷酸酪氨酸抗体将占据许多表位，留下较少的抗体可用于检测。因此建议在TBS+吐温20中使用1%的BSA作为阻断溶液。相关服务:

• • 为什么我的抗体活性在蛋白质印迹中会随着时间的推移而降低？

  可能有这些原因：1、使用了不同的样品；2、样品在储存中或反复冻融时降解；3、抗体被污染；4、样品在储存中或反复冻融时降解导致蛋白质转移效率低下。相关服务:蛋白质免疫印迹和电转移服务

• • 仪器对蛋白质鉴定的灵敏度是多少？

  我们已经在 LTQ-FT 仪器上展示了对蛋白质鉴定 的 50 attomole 的灵敏度。这是通过 1 皮摩尔的 BSA 蛋白质标准品消化完成的，然后将 50 attomole 的等分试样注射入柱中。在 Mascot 数据库搜索中鉴定出 8 到 10 个肽。相关服务:蛋白分析

• • 使用 IMAC 纯化鉴定磷酸化需要多少蛋白质？

  通过 IMAC 纯化分离磷酸化肽可能需要 10皮摩尔或更多的磷酸化蛋白质。然而，这取决于磷酸化肽序列。TiO2是用于分离磷酸化肽的一种可替代且非常灵敏的方法。我们可以使用 IMAC（Galium 或 Fe）或 TiO2来富集蛋白质消化后的磷酸化肽。一些磷酸化可能相对不稳定且难以分析。相关服务

• • 确定蛋白质是否存在磷酸化的最佳方法是什么？你们能定位我的蛋白质上的磷酸化位点吗？

  在可行的情况下，完整的蛋白质分析是确定蛋白质是否具有任何磷酸化的一个好方法，其水平可能高于未修饰蛋白质的 5% 或 10%。完整分析需要皮摩尔量的蛋白质，并且蛋白质必须非常纯。蛋白质消化后进行 nanoLC/MS/MS 分析也是鉴定磷酸化的有效方法。MS/MS 测序用于定位磷酸化位点。相关服

• • 蛋白质样品分析中纯度的重要方面是什么？

  对于完整蛋白质分析，蛋白质样品不含任何数量的去污剂或聚合物尤为重要。对于基于蛋白质消化的溶液样品中的蛋白质鉴定，蛋白质样品不包含去污剂、聚合物并且未暴露于胰蛋白酶抑制剂（如 AEBSF）或其他衍生试剂也很重要。相关服务:蛋白分析

• • 对于使用化学发光的多种蛋白质检测，为什么不能使用同一物种的多种特异性抗体，然后再为该物种提供二级抗体？

  如果你有相同的物种，二级抗体将结合两种蛋白质，你无法区分信号或蛋白质。然而，如果蛋白质条带非常明显（没有非特异性条带）且大小分离良好（大蛋白和小蛋白），则可能使用相同的物种，但通常不建议使用。相关服务:蛋白质免疫印迹和电转移服务

• • 在多重检测的情况下，直接标记第三抗体的最佳（和最简单）方法是什么？

  如果有合适的二级Ab可用，建议标记该二级Ab。在蛋白质高度表达的情况下，也可以标记初级抗体。当只有一个初级抗体时，信号会变弱，因为没有从次级抗体获得放大效果（几个次级抗体与每个初级抗体结合）。相关服务:蛋白质免疫印迹和电转移服务