蛋白分析FAQ汇总

• • 您能否解释一下为什么选中“Use DIA precursor window for exclusion”框？

  此复选框将导致Skyline排除用于从生成的MS/MS谱图中可接受的碎片离子目标组中分离母离子的质荷比（m/z）范围。例如，如果在四极杆设置为600到625的情况下分离前体，则在600到625范围内不允许进行碎片离子选择。假设肽的y8+碎片离子落在这个质荷比（m/z）范围内并且具有DDA谱库

• • 我们如何在预测库中导入？

  您现在可以通过定义目标列表的方法，然后使用 Peptide Settings - Library 选项卡中的 Build 按钮直接在 Skyline 中构建。这提供了对TUM的Prosit预测服务器的直接访问权，并将产生一个包含光谱和 iRT 预测的本地 Skyline 格式 (BLIB)

• • 如果我们不使用iRT肽段，我们能否定义自己的RT校准肽段？

  可以的。在过去的这段时间里，我们在简化此过程方面取得了很大进展，很多工作都有了改进。相关服务:DIA定量蛋白质组学

• • 产品质量分析仪中的 Centroided选项是什么？如果我们在QE-HFx上获取数据，我们可以使用Orbitrap设置吗？

  对于Thermo和Bruker，我们建议使用Centroided选项，该选项适用于供应商的质心光谱。您甚至可以获取您的数据，这样它们就不会保留完整的剖面光谱，因为它使数据更小，我们相信我们可以从仅质心数据中获得所需的数据。对于Bruker Q-TOF数据，这几乎是一项要求，因为他们的剖面数据

• • 我有一个在DIA模式下获取的直接输入数据集。当缺少色谱图时，我必须考虑Skyline中的哪些参数才能正确处理数据？

  不确定，这可以通过支持委员会更好地处理，您可以在那里给出分析方案并提供示例数据。相关服务:DIA定量蛋白质组学

• • 您是否计划进行非线性RT校准，以便在非线性梯度的情况下更好地考虑肽洗脱/分离？

  我们最近在iRT设置中提供了对LOESS和Logorithmic回归的支持，希望这将使Skyline用户更容易访问您所描述的案例。相关服务:DIA定量蛋白质组学

• • 去除重复肽段是否对应于去除蛋白质之间的共有肽段？

  是的，仅保留其蛋白质特有的肽段，这样就可避免计算“蛋白质组”的需要（这会使定量估计变得更加复杂）。相关服务:DIA定量蛋白质组学

• • 是否有根据参考蛋白质组的大小选择每个目标的最佳诱饵数量的指南？

  我不知道有这样的指导方针。对于特定于样本的库，我们通常使用一对一的诱饵生成。对于Pan Human库，可使用一到四诱饵生成，发现检测和量化结果几乎没有下降，但处理性能和生成的文件大小有所提高。相关服务:DIA定量蛋白质组学

• • 隔离窗口导入是否仅适用于.mzml文件、.wiff和.raw文件？一般来说，不转换为.mzmL有什么限制/好处？

  隔离窗口导入与仪器的原始文件格式一样有效（包括来自timsTOF的diaPASEF数据）。我们在此处转换为mzML格式仅用于说明目的，以便我们仅获取供应商文件包含配置文件数据的质心文件。我们不建议您使用自己的数据进行任何到mzML文件格式的转换。相关服务:DIA定量蛋白质组学

• • 如何验证蛋白质测序的结果？

  如果蛋白质序列被成功鉴定，Western blot 是一种很好的验证方法。由于Western blot方法的特异性和敏感性，Western blot鉴定蛋白质可以100%准确地确定蛋白质鉴定结果，排除质谱鉴定的假阳性。可以选择针对上述蛋白质序列制备的单克隆抗体进行检测，通过比较Western