蛋白分析FAQ汇总

• • 蛋白纯化——上样前用于样品过滤的推荐过滤器孔径是多少？

  对于色谱前的样品制备，应根据色谱介质的珠粒大小选择过滤器孔径。90µm或更大的色谱介质粒度—1µm过滤器孔径；30或34µm色谱介质粒度—0.45µm过滤器孔径；3 µm、10 µm、15 µm的色谱介质粒度或需要超净样品或无菌过滤时—0.22µm过滤器孔径；相关服务:蛋白质纯度和均一性表征

• • 蛋白纯化——我感兴趣的蛋白质在纯化过程中“消失”了，我该怎么办？

  这种情况可能是由于：1、蛋白质已被蛋白酶降解——向样品和缓冲液中添加蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解消化；或通过 Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow 等介质运行样品以去除胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。2、样品制备过程中蛋白质吸附至过滤器——使用不同膜类型的过滤器。 再生纤

• • 抗体纯化——我不知道蛋白A或蛋白G是否最适合我的抗体纯化。我应该怎么办？

  蛋白G是实验室规模的通用抗体捕获的首选，与蛋白A相比，蛋白G与更广泛的真核物种的IgG结合。蛋白G还与更多的IgG亚类结合。相关服务:蛋白质纯度和均一性表征

• • 抗体纯化——洗脱后如何保持抗体活性？

  由于抗体纯化中的洗脱步骤通常需要降低 pH 值，因此存在敏感抗体失去活性的风险。为防止这种情况可以用每毫升洗脱液 60 -200 µl 1 M Tris-HCl 缓冲液(pH 9.0 )d的标准准备收集管，这可以保持抗体活性，因为洗脱液的最终 pH 值将接近中性；或者在优化洗脱条件时确定保持

• • 抗体纯化——如何纯化抗体片段？

  蛋白 L 通过与免疫球蛋白轻链的相互作用结合免疫球蛋白。 它首先是从大消化链球菌的表面分离出来的，并命名为蛋白质 L 的轻链。重链的任何部分都不参与相互作用，这意味着蛋白L比蛋白A或蛋白G结合更广泛的抗体种类。Capto L 亲和色谱法培养基(树脂)可特异性地与抗体 kappa 轻链的可变区

• • 标签蛋白纯化——我需要天然的蛋白质，我能把标签撕下来吗？

  答案是肯定的，但删除标签并不总是那么简单。标签去除总是包括使用序列特异性蛋白酶。凝血因子凝血酶和因子Xa是最常用的，但你需要确保它们各自的切割序列（LVPR↓GS和IEGR↓) 不存在于目标蛋白质中。一些标签，例如谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)-标签可以用更具体的蛋白酶去除，例如 PreS

• • 未标记蛋白质纯化——我打算对我的目标蛋白进行功能研究，但我不能引入标签来简化纯化。我该怎么办？

  如果存在与蛋白质特异性结合的配体，则可以通过单个亲和步骤纯化未标记的蛋白质。 如果无法使用亲和步骤，您可能需要使用多步骤纯化策略。多步骤纯化包括根据目标蛋白的性质选择合适的纯化技术组合。相关服务:蛋白质纯度和均一性表征

• • 未标记蛋白质纯化——未标记的好处是什么？ 标记是否纯化更困难？

  如果您对功能研究感兴趣，标签可能会带来不确定性，或者更糟的是，会改变或完全破坏目标蛋白的功能。此外，标签本身会干扰您以您想要的方式使用蛋白质的能力。当蛋白质被用作治疗剂并且您希望尽可能接近天然形式时，这一点尤为重要。相关服务:蛋白质纯度和均一性表征

• • SEC——为什么我的SEC色谱柱分辨率低？

  在尺寸排阻色谱（SEC）中，许多因素会影响分辨率，如介质的粒度、柱长和样品体积。但另一个可能不太明显的方面是液相色谱 (LC) 系统本身。重要的是尽量减少系统中的死体积，例如通过使用短而窄的管道并移除系统流路中所有不必要的组件。相关服务:蛋白质纯度分析（分子筛/反相色谱）

• • SDS-PAGE使用的材料有什么？

  电源：用于将交流电流转换为直流电流。 凝胶：这些凝胶要么在实验室中自行制备，要么从市场上购买。 电泳室：应使用适合的SDS-PAGE凝胶电泳室。 蛋白质样品：蛋白质用SDS-PAGE样品缓冲液溶解并煮沸10分钟。添加还原剂，例如二硫菌醇或2-巯基乙醇，以最大限度地减少二硫键，防止任何叔蛋白折