edman测序样品准备protocol
Edman降解（Edman degradation）是一种经典的蛋白质测序方法，通过逐步切割多肽链的N-末端氨基酸并鉴定它们的顺序来确定蛋白质序列。以下是详细的Edman降解样品准备协议：
一、材料和试剂
1.样品：纯化的蛋白质或多肽
2.试剂：
（1）苯基异硫氰酸酯（PITC）
（2）三氟乙酸（TFA）
（3）水
（4）乙腈
（5）二氯甲烷
（6）1-丁醇
3.设备：
（1）Edman降解自动化仪器（如Procise蛋白质/肽测序仪）
（2）高效液相色谱（HPLC）系统
（3）离心机
（4）微量离心管
（5）玻璃器皿
二、样品准备步骤
1.样品纯化和测量：
（1）确保样品高度纯化，没有其他蛋白质或多肽的污染。
（2）使用紫外分光光度计测量蛋白质浓度，确保浓度适合后续反应。
2.样品降解：
（1）将纯化的蛋白质或多肽溶解在适量的水中，通常使用浓度在0.1-1.0 mg/ml。
（2）取适量样品溶液放入微量离心管中。
3.加PITC反应：
（1）加入适量的苯基异硫氰酸酯（PITC）溶液（通常是乙腈中的PITC溶液）。
（2）在室温下进行反应，通常需要10-20分钟。
4.TFA降解：
（1）反应结束后，加入三氟乙酸（TFA），促进N-末端氨基酸的环化反应。
（2）在室温下继续反应，通常需要10-20分钟。
5.提取PTH衍生物：
（1）反应结束后，使用二氯甲烷或1-丁醇将生成的PTH氨基酸衍生物提取出来。
（2）通过离心分离有机层，收集PTH衍生物。
6.HPLC分析：
（1）将提取的PTH衍生物溶解在适量的乙腈和水的混合溶液中。
（2）使用HPLC系统分离和鉴定PTH衍生物，根据保留时间和已知标准品进行氨基酸的鉴定。
三、注意事项
1.样品纯度：
确保样品纯度高，否则会影响测序结果。
2.反应条件：
严格控制每步的反应时间和温度，确保反应完全。
3.溶剂选择：
选择适合的有机溶剂用于PTH衍生物的提取，确保提取效率高。
4.HPLC标准：
使用已知的PTH氨基酸标准品校准HPLC系统，确保鉴定的准确性。
通过以上步骤，可以逐步切割和鉴定蛋白质或多肽的N-末端氨基酸序列，最终得到目标蛋白质的完整氨基酸序列信息。
百泰派克生物科技--生物制品表征，多组学生物质谱检测优质服务商
相关服务：
How to order?
